[發明專利]基于MRM的植物組蛋白變體H3.3的定量檢測方法

在審

• 申請號: 202110830557.8
• 申請日: 2021-07-22
• 公開（公告）號: CN113567533A
• 公開（公告）日: 2021-10-29
• 發明（設計）人: 胡亞君;金紅
• 申請（專利權）人: 上海市口腔醫院（上海市口腔健康中心）
• 主分類號: G01N27/62
• 分類號: G01N27/62;G01N33/68
• 代理公司: 北京東方盛凡知識產權代理事務所(普通合伙) 11562
• 代理人: 許佳

本發明公開了一種基于MRM的植物組蛋白變體H3.3的定量檢測方法，屬于化學檢測技術領域。所述定量檢測方法包括：鑒定組蛋白變體H3.3K27?R40不同形式修飾的肽段，并合成組蛋白變體H3.3K27?R40不同形式修飾的標準肽段，利用質譜多反應監測技術對所述標準肽段進行質譜定量條件優化，以實現對組蛋白變體H3.3K27?R40不同形式修飾的肽段的定量檢測。該方法實現了基于MRM對植物體內的組蛋白H3.3及其修飾肽段快速、準確和高通量的定量檢測。

技術領域

本發明涉及化學檢測領域，特別是涉及一種基于MRM的植物組蛋白變體H3.3的定量檢測方法。

背景技術

組蛋白作為染色質的組成部分，其翻譯后修飾對染色質的結構和功能起到重要的調控作用。通常認為真核生物染色質的基本單元是核小體，核小體由含147個堿基對的DNA纏繞組蛋白八聚體(由四種組蛋白H2A、H2B、H3和H4組裝而成)構成，核小體之間通過組蛋白H1連接逐步形成其高級結構。除了常規的四種組蛋白外，還包括許多組蛋白的變體，組蛋白不同變體可能攜帶完全不同的生物學信息，例如組蛋白H3.3主要與轉錄激活相關。組蛋白變體和其修飾也共同參與染色質的表觀遺傳?，F有報道發現H3氨基尾端(1-40aa)幾乎所有的賴氨酸和精氨酸上均可發生翻譯后修飾，特別是甲基化和乙?；揎?。關于組蛋白H3.3的功能以及對植物生長發育的影響研究越來越受到重視。H3.3在愈傷組織形成過程中涉及到細胞命運的轉變以及表觀遺傳重編程。H3.3甲基化修飾對愈傷組織形成，進而對植物的生長發育具有重要調控功能?？梢?，精準、高效的定量組蛋白變體H3.3上的翻譯后修飾對理解組蛋白變體信號在植物愈傷組織形成的機制和植物育種中具有重要的意義。

質譜已經成為一項關鍵的組蛋白分析技術，然而組蛋白變體H3.3上翻譯后修飾的分析難點在于組蛋白翻譯后修飾狀態多樣化，各個不同變體間存在相互干擾，同時組蛋白上修飾狀態和修飾位點的精準定位需要高質量的串級譜圖信息。例如僅H3上K27-R40這一肽段上存在兩個重要的修飾位點K27和K36，對應20種不同組合形式的修飾(K27上有5種，K36上有4種)，在常規數據依賴的質譜采集模式下，許多低豐度修飾肽段因為離子強度不夠而被過濾掉，其次，不同變體，不同修飾的肽段常常出現共流出以及混合譜的問題，導致修飾的定位和定量準確度大大降低。目前還沒有一種能夠針對植物組蛋白變體的翻譯后修飾進行準確的定量檢測方法，基于現有技術手段的現狀，本申請的發明人擬提供一種高通量，高靈敏度，以及高可信度的組蛋白變體H3.3的MRM定量方法，本方法能解決植物組蛋白變體H3.3上翻譯后修飾的精準定量問題，并可應用于植物學、表觀遺傳學等領域。

發明內容

本發明的目的是提供一種基于MRM的植物組蛋白變體H3.3的定量檢測方法，以解決上述現有技術存在的問題，基于MRM可以對植物體內的組蛋白H3.3及其修飾肽段快速、準確和高通量的進行定量檢測。

為實現上述目的，本發明提供了如下方案：

本發明提供一種基于MRM的植物組蛋白變體H3.3的定量檢測方法，鑒定組蛋白變體H3.3 K27-R40不同形式修飾的肽段，并合成組蛋白變體H3.3 K27-R40不同形式修飾的標準肽段，利用質譜多反應監測技術對所述標準肽段進行質譜定量條件優化，以實現對組蛋白變體H3.3 K27-R40不同形式修飾的肽段的定量檢測。

優選的是，具體包括以下步驟：

步驟1：提取植物體內組蛋白，通過組蛋白膠內衍生化反應及酶解，獲取組蛋白H3的不同變體；

步驟2：利用HPLC/MS/MS鑒定組蛋白H3變體H3.3 K27-R40不同形式修飾的肽段，并挑選出可用于質譜多反應監測分析用的肽段樣品；

步驟3：合成組蛋白變體H3.3 K27-R40不同形式修飾的標準肽段，篩選特異的母子離子對；

步驟4：利用質譜多反應監測技術對所述標準肽段進行質譜優化，然后利用優化條件定量檢測植物樣本中組蛋白變體H3.3 K27-R40不同形式修飾的肽段含量。