[發(fā)明專利]一種全基因組整體5hmC檢測方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110825701.9
• 申請日: 2021-07-21
• 公開（公告）號: CN113637752B
• 公開（公告）日: 2023-07-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 戴宗;于振寧;鄒小勇
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/6851;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 齊鍵

本發(fā)明公開了一種全基因組整體5hmC檢測方法及其應(yīng)用，本發(fā)明中的全基因組整體5hmC檢測方法，利用PolyT穩(wěn)定熒光銅納米顆粒檢測5hmC，通過加入ddTTP和TdT封端，加熱滅活TdT后再加入UDP?6?N3?Glu和T4?βGT，并加入探針和銅納米顆粒，通過將大量熒光信號的分子修飾在一個5hmC位點上，實現(xiàn)高效5hmC信號的放大，提高熒光檢測靈敏度，并使樣品量可以達(dá)到5ng，且無需大型儀器和磁珠富集，可適用于所有核酸的檢測。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種全基因組整體5hmC檢測方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要研究內(nèi)容。基因組中的胞嘧啶作為遺傳密碼的一部分，通過其嘧啶環(huán)的化學(xué)修飾攜帶表觀遺傳信息，這些化學(xué)修飾主要是5-甲基胞嘧啶(5mC)及其氧化產(chǎn)物5-羥甲基胞嘧啶(5hmC)、5-醛基胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC)。5mC可以使基因表達(dá)沉默，但其可以通過TET酶介導(dǎo)的氧化和一系列主動去甲基化過程使沉默的基因重新表達(dá)，因此，5mC的氧化產(chǎn)物對于基因精確調(diào)控具有重大意義。而且，5hmC也是潛在的癌癥標(biāo)志物，異常的5hmC水平與癌癥的發(fā)生和發(fā)展具有密切聯(lián)系，因此，5hmC的檢測對于癌癥的早期篩選和治療具有指導(dǎo)意義。

相關(guān)技術(shù)中，5hmC的檢測方法主要包括：依賴于重亞硫酸鹽的測序技術(shù)、質(zhì)譜法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、薄層色譜法和基于抗體的檢測方法。但是，由于5hmC在基因組中含量極低，且自身結(jié)構(gòu)與其他堿基高度相似，機(jī)加之各種檢測儀器操作的復(fù)雜性和靈敏度限制，使5hmC在基因組中的實際檢測情況并不理想。而且，檢測5hmC的樣品量通常需要達(dá)到微克級別，對樣品的要求相對較高，從而進(jìn)一步提高了其檢測難度。

因此，開發(fā)這一種低成本、高靈敏度、低樣本量的全基因組5hmC定量方法對于5hmC及其相關(guān)研究具有極為重大的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明提出一種全基因組整體5hmC檢測方法及其應(yīng)用，能夠不基于復(fù)雜的儀器操作，實現(xiàn)微克級別的全基因組5hmC檢測效果，有效降低了檢測成本和檢測難度，實現(xiàn)了全基因組5hmC的高效準(zhǔn)確檢測。

根據(jù)本發(fā)明的第一個方面，提供一種探針，該探針的核苷酸序列為：5’-CCGGAGTCCGCTTTCCTCTT-3’(SEQ?ID?NO.2)。

該探針能夠準(zhǔn)確識別目標(biāo)5hmC位點，從而啟動后續(xù)反應(yīng)。

在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述探針用于靶向SEQ?ID?NO.1或含有SEQ?IDNO.1所示核苷酸序列基因的5hmC或全基因組的5hmC。

當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以設(shè)計其他任何大于三個堿基的DNA鏈作為探針均可，原因在于該探針僅針對于5hmC，而非特定的靶序列，因此，只要5’端修飾DBCO且長度大于三個堿基的寡核苷酸鏈即可。

在本發(fā)明的第一個方面中，在本發(fā)明的一些實施方式中，所述探針的5’端連接有點擊化學(xué)試劑。

在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述點擊化學(xué)試劑包括：乙炔和二苯并環(huán)辛炔中的任意一種。

當(dāng)然，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)實際使用需求，合理選擇其他點擊化學(xué)試劑使其可以實現(xiàn)“Click”反應(yīng)。

本發(fā)明的第二個方面，提供一種5hmC檢測試劑，該5hmC檢測試劑中含有本發(fā)明第一個方面所述的探針。

該檢測試劑能夠準(zhǔn)確識別靶標(biāo)序列，從而啟動后續(xù)反應(yīng)。

在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，所述探針用于靶向SEQ?ID?NO.1或含有SEQ?IDNO.1所示核苷酸序列基因的5hmC或全基因組的5hmC。