[發(fā)明專利]一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110810072.2
• 申請(qǐng)日: 2021-07-18
• 公開（公告）號(hào): CN113832188A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范春雷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州邁爾德生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/867
• 分類號(hào): C12N15/867;C12N15/62;C12N7/04;G01N33/569;G01N33/68;G01N33/558;G01N33/548;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。試劑盒包括帶熒光蛋白標(biāo)簽的新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒、重組人ACE2蛋白、抗人IgG抗體、兔抗新型冠狀病毒棘突蛋白多抗、層析試紙條等相關(guān)材料。本發(fā)明通過配體?受體法競(jìng)爭(zhēng)法定量分析新型冠狀病毒感染后或接種疫苗后體內(nèi)是否產(chǎn)生抗新冠病毒S1蛋白的中和抗體，并計(jì)算出中和抗體的抑制率。中和抗體的抑制率，即抗新型冠狀病毒S蛋白總IgG抗體的獲得率可作為新冠肺炎患者康復(fù)后和疫苗接種者血清保護(hù)抗體的評(píng)估。抗新型冠狀病毒S蛋白總IgG抗體的獲得率越高表明免疫產(chǎn)生的抗體越多；中和抗體的抑制率越高表明中和阻斷抗體越多，保護(hù)作用越強(qiáng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用。

背景技術(shù)

冠狀病毒在系統(tǒng)分類上屬冠狀病毒科(Coronaviridae)冠狀病毒屬(Coronavirus)。冠狀病毒屬的病毒是具外套膜(envelope)的正鏈單股RNA病毒，直徑約80～120nm，其遺傳物質(zhì)是所有RNA病毒中最大的，感染宿主包括人、鼠、蝙蝠、豬、貓、穿山甲、犬、狼、雞、牛、蛇類、禽類等脊椎動(dòng)物。2019新型冠狀病毒(SARS-CoV-19,曾用名2019-nCoV)是目前已知的第7種可以感染人的冠狀病毒，其余6種分別是HCoV-229E、HCoV-OC43、HCoV-NL63、HCoV-HKU1、SARS-CoV和MERS-CoV。研究表明，其中SARS-CoV-19、SARS-CoV和HCoV-NL63是通過病毒包膜spike glycoprotein(S-protein)介導(dǎo)病毒與宿主細(xì)胞膜上的ACE2受體相互作用來感染人的。人感染了新型冠狀病毒后常見體征有呼吸道癥狀、發(fā)熱、咳嗽、氣促和呼吸困難等。在較嚴(yán)重病例中，感染可導(dǎo)致肺炎、嚴(yán)重急性呼吸綜合征、腎衰竭，甚至死亡。血清中抗病毒IgM抗體是病毒復(fù)制和早期感染的標(biāo)志，隨后會(huì)有IgG抗體升高，因而血清學(xué)IgM/IgG抗體通常作為病毒感染的檢測(cè)指標(biāo)，且可判斷近期感染和既往感染。對(duì)于感染后產(chǎn)生的抗病毒IgG抗體通常有防止機(jī)體再次被感染的作用。另一方面，防治新冠肺炎最直接和有效的方法是接種疫苗，通過接種新型冠狀病毒疫苗，誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生抗新型冠狀病毒的抗體，從而保護(hù)機(jī)體免受新型冠狀病毒侵染。但是，無(wú)論是感染病毒后產(chǎn)生的自然免疫，還是接種疫苗后的人工免疫，并非病毒或疫苗誘生的所有抗體都能起到保護(hù)作用，只有那些能夠阻斷病毒和人體細(xì)胞結(jié)合的抗體才能起到較好的保護(hù)作用，這種抗體通常被稱為中和抗體。目前，對(duì)疫情中或疫情后流行病血清學(xué)調(diào)查主要是檢測(cè)血清總抗體；但如果能同時(shí)檢測(cè)出中和抗體的含量則對(duì)預(yù)后及再次感染的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估具有重要意義。同樣，對(duì)于接種疫苗后如果能在檢測(cè)總抗體的同時(shí)檢測(cè)中和抗體的含量，則對(duì)評(píng)估疫苗的效果及是否需要和何時(shí)再次免疫具有重要意義。

那么，如何檢測(cè)出中和抗體呢？新型冠狀病毒入侵人體細(xì)胞的機(jī)制是新型冠狀病毒通過其表面的棘突蛋白S(配體)與人細(xì)胞膜上的ACE2受體特異性結(jié)合入侵人體細(xì)胞。研究表明，新冠病毒的S蛋白與人ACE2受體有非常強(qiáng)的結(jié)合力，親和力為15nM(平衡解離常數(shù))，比SARS病毒強(qiáng)10-20倍。S蛋白與ACE2結(jié)合的區(qū)域稱為受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域(ReceptorBinding Domain,RBD)。所謂中和抗體就是以RBD為靶點(diǎn)并起到能夠阻斷S蛋白配體與ACE2受體結(jié)合的抗體。因此，我們可以建立配體-受體競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)系統(tǒng)特異地分析血清中新冠病毒中和抗體的含量。。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)存在的上述技術(shù)問題，我們根據(jù)配體與受體特異性結(jié)合的原理，發(fā)明了一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測(cè)方法及試劑盒制備。

一種含有帶熒光蛋白標(biāo)簽的新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒,制備方法包括以下步驟：

1)將新型冠狀病毒棘突蛋白的C末端接上熒光蛋白，將其標(biāo)記為nCoVS-熒光蛋白；該人工設(shè)計(jì)序列經(jīng)宿主細(xì)胞密碼子優(yōu)化后基因合成并亞克隆到慢病毒表達(dá)載的CMV啟動(dòng)子下，構(gòu)建表達(dá)新型冠狀病毒棘突蛋白S-熒光蛋白融合蛋白的質(zhì)粒，將其標(biāo)記為pMLD-nCoVS-熒光蛋白；