[發明專利]一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測試劑盒及應用

在審

• 申請號: 202110810072.2
• 申請日: 2021-07-18
• 公開（公告）號: CN113832188A
• 公開（公告）日: 2021-12-24
• 發明（設計）人: 范春雷
• 申請（專利權）人: 杭州邁爾德生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/62;C12N7/04;G01N33/569;G01N33/68;G01N33/558;G01N33/548;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 朱瑩瑩

1.一種含有帶熒光蛋白標簽的新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒,制備方法包括以下步驟：

1)將新型冠狀病毒棘突蛋白的C末端接上熒光蛋白，將其標記為nCoVS-熒光蛋白；該人工設計序列經宿主細胞密碼子優化后基因合成并亞克隆到慢病毒表達載的CMV啟動子下，構建表達新型冠狀病毒棘突蛋白S-熒光蛋白融合蛋白的質粒，將其標記為pMLD-nCoVS-熒光蛋白；

2)將步驟1)構建好的質粒pMLD-nCoVS-熒光蛋白與pH1質粒、pH2質粒共轉染到慢病毒包裝系細胞293V，制備nCoVS-熒光蛋白慢病毒，并轉染新的293V細胞，熒光顯微鏡下挑取高表達克隆，建立nCoVS-熒光蛋白/293V穩轉細胞系；

3)將步驟1)構建好的質粒pMLD-nCoVS-熒光蛋白與pH1質粒、pH2質粒共轉染到A步驟2)建立的nCoVS-熒光蛋白/293V穩轉細胞系，轉染后48小時和72小時各收集培養上清液一次；合并兩次收集的上清液，4℃,4000g離心10分鐘，棄沉淀；取上清，4℃,20000g離心20分鐘，棄沉淀；取上清，過0.45μm孔徑濾膜后，4℃,85000g離心90分鐘，棄上清；沉淀即為新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒，將其標記為nCoVSpsvirus-熒光蛋白；用pH7.4的PBS溶液重懸，制備含新型冠狀病毒棘突蛋白S濃度≧1mg/ml的假病毒懸液；

4)用偶聯抗新型冠狀病毒棘突蛋白S蛋白抗體的磁珠純化從步驟3)制備的新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒重懸液，并制備成含新型冠狀病毒棘突蛋白S濃度≧1mg/ml的假病毒PBS懸液。

2.如權利要求1所述的新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒，其特征在于：步驟1)中，所述新型冠狀病毒棘突蛋白基因為GenBank:NC_045512.2中編碼Spike glycoprotein(GeneID:43740568)的基因序列；所述熒光蛋白為tdTomato；所述密碼子優化的宿主為人；

其中，表達新型冠狀病毒棘突蛋白和tdTomato熒光蛋白標簽的人工設計序列經人宿主細胞密碼子優化后的核酸序列如SEQ ID NO：1所示，構建好的質粒所表達的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.權利要求1所述新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒用于制備檢測新型冠狀病毒中和抗體的試劑盒。

4.基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測試劑盒，其特征在于：含有帶熒光蛋白標簽的新型冠狀病毒棘突蛋白假病毒。

5.如權利要求4所述的一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括免疫層析試紙條，免疫層析試紙條包括底襯、硝酸纖維素膜、樣品墊、釋放墊和吸水紙。

6.權利要求4所述的一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測試劑盒的制備方法，樣品墊、釋放墊、硝酸纖維素膜和吸水紙搭接組裝在底襯上，釋放墊和吸水紙分別疊壓在硝酸纖維素膜的兩端，并在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區，樣品墊疊壓在釋放墊上；檢測區的硝酸纖維素膜上設置靠近釋放墊的二條檢測線區(T1、T2線)和靠近吸水紙的一條控制線區(C線)。將nCoVSpsvirus-tdTomato噴涂在釋放墊上；在硝酸纖維素膜上T1、T2、C線區分別包被人源ACE2蛋白、抗人IgG抗體、和兔抗新型冠狀病毒棘突蛋白多抗，獲得血清和血漿新型冠狀病毒棘突蛋白中和抗體和總抗體檢測試紙條。

7.一種基于熒光蛋白的新型冠狀病毒中和抗體快速檢測方法，其特征在于：所述血清和血漿新型冠狀病毒棘突蛋白中和抗體和總抗體檢測試紙條，采用干式熒光層析分析儀定量分析；提供中和抗體的陰/陽性、抑制率，抗新型冠狀病毒S蛋白總IgG抗體的陰/陽性、獲得率等指標。其中，中和抗體的抑制率根據公式1來計算；檢測樣本中SARS-CoV-2中和抗體的陰/陽性判斷可根據抑制率來設定，具體檢測限可在10％-100％的抑制率范圍內設定；

公式1:

總IgG抗體的獲得率根據公式2來計算；檢測樣本中SARS-CoV-2中和總IgG抗體的陰/陽性判斷可根據獲得率來設定，具體檢測限可在200％以上的獲得率范圍內設定；

公式2：