[發明專利]一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法

在審

• 申請號: 202110806056.6
• 申請日: 2021-07-16
• 公開（公告）號: CN113498738A
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 張光海;陳學軍;李永平;高玉龍;焦芳嬋;吳興富;馮智宇;許美玲;孔光輝;吳玉萍;姚恒;趙高坤;李薇
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 吳金姿

本發明公開了一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，屬于煙草的多倍體育種技術領域，包括無菌苗培育、離體嫁接、嫁接結合部位愈傷誘導、不定芽誘導和生根培養、再生植株移栽、再生植株表型篩選鑒定和倍性鑒定等步驟。本發明采用紅花栽培煙草與黃花煙草作為嫁接親本材料，利用試管離體嫁接技術實現煙草基因組水平轉移；利用人工組織培養技術，實現兩個嫁接親本的嫁接接合愈傷組織誘導及無性株系再生，克服了兩種近緣煙草種間有性育種障礙，并形成可育的煙草異源多倍體植株。

技術領域

本發明涉及煙草的多倍體育種技術領域，更具體地說，涉及一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法。

背景技術

異源多倍體是來自兩個不同物種的基因組的組合，是物種進化主要來源，許多現代作物植物的優異性狀是通過異源多倍體化途徑獲得，如普通煙草的形成就是林煙草與絨毛狀煙草雜交后，經染色體自然加倍形成的異源四倍體。越來越多的研究發現，不同物種的細胞緊密接合時會誘發遺傳物質的水平轉移，即受體生物通過無性方式從供體生物獲得遺傳物質的過程，有別于世代繁衍過程中的有性傳遞方式。水平基因轉移又稱橫向基因轉移，新基因對物種的起源、演化及對環境的適應性具有重要作用，而水平基因轉移作為物種引入新基因的一條重要途徑，水平基因轉移能跨越種間隔離，在親緣關系遠或近的生物有機體間都可以進行遺傳信息轉移。可以使受體生物繞過點突變和重組快速形成新物種，加速基因組的革新和進化，提高生物遺傳多樣性。砧木和接穗在愈傷組織、細胞壁、維管組織的重建過程中伴隨著遺傳物質在細胞間的轉移。植物間的嫁接可以導致DNA片段或者整個質體基因組的交流。嫁接接合部位通過離體培養誘導愈傷組織產生的不定芽則被稱之為嫁接嵌合體；嵌合體誘導技術能夠克服遠緣或近緣間植物有性育種障礙，并形成可育的異源多倍體。異源多倍體可以通過無性機制發生，嫁接可作為一種創制新異源多倍體的快速方法。

目前，由于煙草育種長期選用較單一的栽培品種作為親本進行品種間雜交選育新品種，導致國內栽培煙草種質間親緣關系較近、遺傳基礎狹窄、遺傳多樣性較低，是目前煙草育種面臨的突出問題。煙草遠緣雜交是實現將野生煙草中顯性抗病蟲基因直接轉移到普通栽培煙草的有效途徑。因此，拓寬和豐富煙草栽培種的遺傳基礎，發掘煙草屬野生種的遺傳潛力，創制攜帶有優良基因的骨干親本材料是煙草育種亟待解決的問題。然而，煙草種間普遍存在生殖隔離，如普通紅花煙草和黃花煙草，普通紅花煙草與大部分野生煙草均存在嚴重的生殖隔離。因此，如何有效克服普通紅花煙草與黃花煙草或野生煙草的有性雜交不親和是目前煙草遠緣雜交育種亟需解決的技術問題。

發明內容

本發明的目的在于提供一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，本發明采用紅花栽培煙草與黃花煙草作為嫁接親本材料，利用試管離體嫁接技術實現煙草基因組水平轉移；利用人工組織培養技術，實現兩個嫁接親本的嫁接接合愈傷組織誘導及無性株系再生；克服兩種近緣煙草種間有性育種障礙，并形成可育的異源多倍體。

為解決上述問題，本發明采用如下的技術方案：

一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，該方法包括如下步驟：

(1)無菌苗培育：在組培室中將紅花煙草種子和黃花煙草種子預處理后分別播種于含固體培養基的培養皿中，培養兩周后將生長至小十字期的幼苗移植至含有固體培養基的培養瓶中，把培養瓶放入組培室中每天光照培養16小時，每天黑暗培養8小時，待紅花煙草植株和黃花煙草幼苗植株生長至株高5-10cm后作為嫁接親本；

(2)離體嫁接：將步驟(1)中得到的嫁接親本進行交互嫁接得到嫁接體，將得到的嫁接體置于MS培養基中培養2-4周至嫁接結合部位融合完好，得到結合部位具有維管組織的接穗植株，所述接穗植株可正常生長；

(3)嫁接結合部位愈傷誘導：切下步驟(2)中得到的接穗植株上的嫁接結合部位，用刀片將嫁接緊密結合部位橫切成多塊薄片，將每塊薄片分別平放于含有愈傷固體培養基的培養瓶中培養25d，進行愈傷組織誘導，得到多塊愈傷組織塊；