[發明專利]一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法

在審

• 申請號: 202110806056.6
• 申請日: 2021-07-16
• 公開（公告）號: CN113498738A
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 張光海;陳學軍;李永平;高玉龍;焦芳嬋;吳興富;馮智宇;許美玲;孔光輝;吳玉萍;姚恒;趙高坤;李薇
• 申請（專利權）人: 云南省煙草農業科學研究院
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 吳金姿

1.一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：該方法包括如下步驟：

(1)無菌苗培育：在組培室中將紅花煙草種子和黃花煙草種子預處理后分別播種于含固體培養基的培養皿中，培養兩周后將生長至小十字期的幼苗移植至含有固體培養基的培養瓶中，把培養瓶放入組培室中每天光照培養16小時，每天黑暗培養8小時，待紅花煙草植株和黃花煙草幼苗植株生長至株高5-10cm后作為嫁接親本；

(2)離體嫁接：將步驟(1)中得到的嫁接親本進行交互嫁接得到嫁接體，將得到的嫁接體置于MS培養基中培養2-4周至嫁接結合部位融合完好，得到結合部位具有維管組織的接穗植株，所述接穗植株可正常生長；

(3)嫁接結合部位愈傷誘導：切下步驟(2)中得到的接穗植株上的嫁接結合部位，用刀片將嫁接緊密結合部位橫切成多塊薄片，將每塊薄片分別平放于含有愈傷固體培養基的培養瓶中培養25d，進行愈傷組織誘導，得到多塊愈傷組織塊；

(4)不定芽誘導和生根培養：將步驟(3)中得到的多塊愈傷組織塊分別轉移至含MS培養基的培養瓶中誘導愈傷組織塊產生不定芽，將形成的不定芽分別移植至含固體培養基的培養瓶中進行培養，得到再生植株；重復上述步驟，直至不再產生不定芽；

(5)再生植株移栽：用蒸餾水將步驟(4)中得到的再生植株的根部培養基沖洗干凈，移栽至裝有滅菌基質的營養缽中煉苗，煉苗25-30天后移栽至溫室的花盆中，按常規煙草進行管理栽培，得到再生植株；

(6)再生植株的表型篩選：將步驟(5)中得到的再生植株進行表型篩選，篩選出具有種間異源多倍體特性的植株；

(7)倍性鑒定：鑒定步驟(6)中得到的具有種間異源多倍體特性植株的倍性，篩選多倍體，即得到多株煙草種間異源多倍體新種質植株。

2.根據權利要求1所述的一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：所述步驟(1)中的預處理為用次氯酸鈉溶液進行消毒預處理后用無菌水清洗3次；所述光照培養的光照強度為50μEm^-2S^-1，光照培養的溫度為24℃，所述黑暗培養的溫度為22℃。

3.根據權利要求1所述的一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：所述步驟(1)和步驟(4)中的固體培養基的組成為：4.74g/L MS、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂和蒸餾水，固體培養基的pH為5.8。

4.根據權利要求1所述的一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：所述步驟(3)中的愈傷固體培養基的組成為：4.74g/L MS、5mg/L KT、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L瓊脂，愈傷固體培養基的pH為5.8。

5.根據權利要求1所述的一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的交互嫁接方法為：選取紅花煙草幼苗植株作為接穗植株，留取接穗植株頂上的2片小葉，去除其余葉片，將接穗植株沿莖兩側對稱斜切45°后成楔形狀接口；選取黃花煙草幼苗植株作為砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的莖段，其余剪去，用雙面刀片從留取的莖中部劈開與接穗植株楔形狀接口相配合的接口；將接穗植株楔形端插入砧木植株接口，用塑料套管將接口進行固定完成交互嫁接。

6.根據權利要求1所述的一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：所述步驟(2)中的交互嫁接方法為：選取黃花煙草幼苗植株作為接穗植株，留取接穗植株頂上的2片小葉，去除其余葉片，將接穗植株沿莖兩側對稱斜切約45°后成楔形狀接口；選取紅花煙草幼苗植株作為砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的莖段，其余剪去，用雙面刀片從留取的莖中部劈開與接穗植株楔形狀接口相配合的接口；將接穗植株楔形端插入砧木植株接口，用塑料套管將接口進行固定完成交互嫁接。

7.根據權利要求1所述的一種利用水平基因組轉移創制煙草種間異源多倍體新種質的方法，其特征在于：所述嫁接緊密結合部位切成的薄片厚度為1-2mm。