[發(fā)明專利]一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110800496.0
• 申請(qǐng)日: 2021-07-15
• 公開（公告）號(hào): CN113292641A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 殷俊;溫萌;程君;葉英;楊莉;李家斌
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 李家斌
• 主分類號(hào): C07K14/195
• 分類號(hào): C07K14/195;C07K1/22;C12N15/31;C12N15/70
• 代理公司: 合肥銘輝知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 34212
• 代理人: 張名列

本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法，解決了現(xiàn)有技術(shù)中尚無較好的體外誘導(dǎo)以及大量表達(dá)恙蟲病東方體相關(guān)蛋白的方法和相適應(yīng)的條件的問題，所述用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法，包括引物合成、目的基因的獲取與擴(kuò)增、重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建、恙蟲病東方體相關(guān)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、Western blot試驗(yàn)、重組蛋白表達(dá)形式分析、重組蛋白純化等步驟。本發(fā)明設(shè)計(jì)了一種恙蟲病東方體TSA蛋白獲取的方法，通過探索調(diào)整蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件及蛋白純化方法，成功體外誘導(dǎo)表達(dá)恙蟲病東方體相關(guān)TSA蛋白，同時(shí)提高體外蛋白的純度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法。

背景技術(shù)

恙蟲病是一種自然疫源性疾病，又稱叢林性斑疹傷寒，由專性細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌恙蟲病東方體引起的一種容易被忽略的潛在的致命感染性疾病，恙蟲病每年發(fā)生100萬余例，已有研究發(fā)現(xiàn)，恙蟲病如果沒有接受及時(shí)的治療，病死率的發(fā)生很可能大于登革熱而達(dá)到10%的病死率，尤其在患者還未接受抗生素治療的時(shí)候，該病的死亡率甚至可以高達(dá)40%-45%。

恙蟲病東方體寄生于恙螨，人被恙螨叮咬后，在人體血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)、繁殖，其潛伏期一般為7-21天，臨床表現(xiàn)主要有寒戰(zhàn)、發(fā)熱等非特異性癥狀，重癥感染表現(xiàn)為感染性休克、彌散性血管內(nèi)凝血甚至死亡。而恙蟲病由于起病初期的非特異性癥狀很難與其他發(fā)熱性疾病如發(fā)熱伴血小板減少綜合征、流行性出血熱等疾病鑒別，所以，目前對(duì)于恙蟲病相關(guān)致病機(jī)制的研究報(bào)道幾乎依舊處于空白領(lǐng)域。雖然隨著研究的不斷深入，PCR和血清學(xué)檢測(cè)及敏感抗生素的治療得以發(fā)展，但快速準(zhǔn)確的高敏感性和特異性的診斷方法及疫苗的研究依舊具有重要的意義。

恙蟲病患者的早期診斷和治療對(duì)于改善疾病的預(yù)后至關(guān)重要，因此建立快速且準(zhǔn)確的恙蟲病診斷方法至關(guān)重要，而恙蟲病患者的血清已經(jīng)被證明可以與幾種恙蟲病主要抗原反應(yīng)，包括主要外膜56-kDa（TSA）蛋白，它占立克次體細(xì)胞蛋白總含量的10- 15%以及其他次要蛋白，如22-kDa、47-kDa和110-kDa蛋白等，而由于56-kDa型特異性抗原(TSA)位于恙蟲病立克次體表面的免疫顯性。已有研究發(fā)現(xiàn)56kDa（TSA）蛋白是一種免疫顯性的抗原，具有群體特異性和菌株特異性的表位，可以與單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)，雖然其抗原多樣性與不同菌株的分子變異程度有關(guān)，但是，大多數(shù)恙蟲病患者的血清可以識(shí)別TSA蛋白，因此TSA蛋白被認(rèn)為是合適的診斷性抗原和候選疫苗。

現(xiàn)階段對(duì)于恙蟲病東方體56kDa蛋白對(duì)機(jī)體的致病機(jī)制的研究人員較多，但是如何穩(wěn)定于體外獲得純度較高的恙蟲病東方體相關(guān)蛋白一直是一個(gè)難點(diǎn)，目前尚無較好的體外誘導(dǎo)以及大量表達(dá)恙蟲病東方體相關(guān)蛋白的方法和相適應(yīng)的條件。基于上述陳述，本發(fā)明提出了一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中尚無較好的體外誘導(dǎo)以及大量表達(dá)恙蟲病東方體相關(guān)蛋白的方法和相適應(yīng)的條件的問題，而提出的一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法。

一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及大量純化的方法，包括以下步驟：

（1）引物合成：參照GenBank及所需要的酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)恙蟲病東方體TSA致病蛋白引物1-30條，共計(jì)30條引物，采用overlapPcr方法合成該蛋白序列全長(zhǎng)。

（2）目的基因的獲取與擴(kuò)增：合成恙蟲病東方體TSA蛋白，PCR擴(kuò)增TSA蛋白全長(zhǎng)序列，依次進(jìn)行全長(zhǎng)PCR一輪、全長(zhǎng)PCR二輪反應(yīng)，反應(yīng)完成后，將全長(zhǎng)PCR二輪產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，回收TSA目的片段備用；