[發明專利]一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導表達及大量純化的方法

在審

• 申請號: 202110800496.0
• 申請日: 2021-07-15
• 公開（公告）號: CN113292641A
• 公開（公告）日: 2021-08-24
• 發明（設計）人: 殷俊;溫萌;程君;葉英;楊莉;李家斌
• 申請（專利權）人: 李家斌
• 主分類號: C07K14/195
• 分類號: C07K14/195;C07K1/22;C12N15/31;C12N15/70
• 代理公司: 合肥銘輝知識產權代理事務所(普通合伙) 34212
• 代理人: 張名列

1.一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導表達及大量純化的方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）引物合成：參照GenBank及所需要的酶切位點設計恙蟲病東方體TSA致病蛋白引物1-30條，共計30條引物，采用overlapPcr方法合成該蛋白序列全長。

2.（2）目的基因的獲取與擴增：合成恙蟲病東方體TSA蛋白，PCR擴增TSA蛋白全長序列，依次進行全長PCR一輪、全長PCR二輪反應，反應完成后，將全長PCR二輪產物經1%瓊脂糖凝膠電泳，回收TSA目的片段備用；

（3）pET30a-TSA重組表達質粒的構建：PCR擴增的同時，用BamHI-Xhol雙酶切處理pET30a質粒，進行膠回收，重組反應體系為：步驟（2）中的TSA回收產物4ul，pET30a＋載體3.5ul，重組酶2.5ul,50℃水浴25min，放置2-3分鐘降溫，進行菌落篩選實驗，挑取單克隆菌落，振蕩培養12-14h，保存菌液，提取質粒并送測序，即得重組菌菌液；

（4）恙蟲病東方體TSA蛋白的誘導表達：將經過測序保存的重組菌菌液，于37℃， 220r/min震蕩培養至菌液D600為0.6-0.8時，加入0.4mM的IPTG進行誘導表達，收集菌液超聲處理后，獲得蛋白樣品；

（5）Western blot 試驗：使用步驟（4）中的蛋白樣品，以12%的分離膠進行SDS-PAGE試驗，將蛋白轉移至硝酸纖維素膜5%脫脂乳封閉1h，鼠源His抗體孵育過夜，PBST洗滌4次，每次5min，使用HRP標記的山羊抗小鼠二抗37℃孵育1h，PBST洗滌4次，5min每次，顯影；

（6）恙蟲病東方體TSA重組蛋白表達形式分析：步驟（3）中保存的重組菌，加入IPTG進行誘導表達，收取菌液，經超聲破碎后，4000r/min離心10min，收取上清，用PBS重懸沉淀，分別取上清、細菌包涵體制備樣品，用12%的分離膠進行SDS-PAGE試驗；

（7）恙蟲病東方體TSA重組蛋白純化：復蘇TSA蛋白相關重組菌，轉移到1L培養基中，37℃條件下振蕩培養至菌液D600為0.6-0.8,加入0.2mM的IPTG進行誘導表達，4h后收集蛋白，采用Ni-IDA親和層析柱進行純化，制備蛋白樣品，用12%的分離膠進行SDS-PAGE試驗，分析蛋白純化效果；

（8）通過上述流程，成功于體外誘導表達純化獲取了大量純度較高的恙蟲病東方體TSA重組蛋白。

3.根據權利要求1所述的一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導表達及大量純化的方法，其特征在于，所述步驟（2）中全長PCR一輪反應體系為50ul：在PCR管中依次加入ddH2O38ul,聚合酶（pv2）0.5ul，5 X PV2 buffer 10ul,10mM dNTP 1ul，引物1-30各0.5ul。

4.根據權利要求1所述的一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導表達及大量純化的方法，其特征在于，所述步驟（2）中全長PCR一輪反應擴增條件為：95℃預變性 3 min;95℃變性25s，62℃退火20 s，72℃延伸 45 s，25個循環；72℃延伸1 min。

5.根據權利要求1所述的一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導表達及大量純化的方法，其特征在于，所述步驟（2）中全長PCR二輪反應體系為50ul：在PCR管中依次加入ddH2O37.2ul,聚合酶（pv2）0.5ul，5 X PV2 buffer 10ul,10mM dNTP 1ul，引物1 0.5ul,引物300.5ul。

6.根據權利要求1所述的一種用于恙蟲病東方體TSA蛋白誘導表達及大量純化的方法，其特征在于，所述步驟（2）中全長PCR二輪擴增條件為：95℃預變性 3 min;95℃變性25s，62℃退火20 s，72℃延伸 45 s，25個循環；72℃延伸1 min。