[發(fā)明專利]一組檢測核酸的DNAzyme探針及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110799522.2
• 申請日: 2021-07-15
• 公開（公告）號: CN113528511B
• 公開（公告）日: 2023-03-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳俊;黃婷;陳金香;謝寶平;段文軍
• 申請（專利權(quán)）人: 南方醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/682
• 代理公司: 廣州嘉權(quán)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 44205
• 代理人: 齊鍵

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，公開了一組檢測核酸的DNAzyme探針及其應(yīng)用。該DNAzyme探針，包含酶鏈H1、底物鏈H2、酶鏈H3和底物鏈H4。該DNAzyme探針可以特異性識別目標(biāo)核酸，實(shí)現(xiàn)基于DNAzyme的指數(shù)級信號放大，反應(yīng)動力學(xué)提高，檢測限降低，僅為0.15fM，相比傳統(tǒng)的DNAzyme探針檢測限降低了3個數(shù)量級(傳統(tǒng)的DNAzyme探針檢測限為0.2pM)，同時，檢測靈敏度比傳統(tǒng)的DNAzyme探針提高了1333倍，即本發(fā)明提供的DNAzyme探針靈敏度高、檢測限低、特異性強(qiáng)。并且具有更優(yōu)的反應(yīng)動力學(xué)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一組檢測核酸的DNAzyme探針及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

MicroRNA(miRNA)是一類廣泛存在于真核生物中的，長度約為19-22個堿基的的非編碼短鏈RNA，可以調(diào)節(jié)多種生物過程，包括細(xì)胞分化，細(xì)胞增殖和凋亡等。miRNAs的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，因此，miRNA被作為癌癥的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。發(fā)展miRNA的高靈敏高特異性定量檢測方法對疾病診斷和了解疾病的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要，特別是活細(xì)胞內(nèi)miRNA的成像更具吸引力，因?yàn)槠淇梢员苊鈴?fù)雜的提取過程，保證細(xì)胞的活性，且能為癌癥相關(guān)miRNAs表達(dá)的研究提供可視化時間和空間方面的信息。

miRNA的表達(dá)水平較低，且同源相似度高。實(shí)現(xiàn)高靈敏高特異性miRNA分析是一大難點(diǎn)。基于此，研究者提出了多種恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)用于構(gòu)建更高靈敏度的檢測方法，如滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)、環(huán)介導(dǎo)指數(shù)擴(kuò)增(LAMP)、恒溫指數(shù)擴(kuò)增(EXPAR)，這些酶參與的擴(kuò)增方法效率高，但生物酶昂貴且受檢測環(huán)境影響較大，檢測準(zhǔn)確度較低。同時生物酶難以轉(zhuǎn)染進(jìn)活細(xì)胞，這些方法不適用于活細(xì)胞內(nèi)miRNA分析。無酶參與的恒溫?cái)U(kuò)增包括雜交鏈反應(yīng)(HCR)、催化發(fā)夾自組裝反應(yīng)(CHA)和DNAzyme切割擴(kuò)增反應(yīng)等，這些方法擺脫了生物酶的干擾，準(zhǔn)確度高，被廣泛用于細(xì)胞內(nèi)外核酸分析，其中DNAzyme切割擴(kuò)增反應(yīng)由于較低的背景信號和較快的反應(yīng)速率受到較多的關(guān)注。

DNAzyme是一類在金屬離子存在的條件下特異性切割底物RNA鏈的脫氧核苷酸，具有無限切割底物和可循環(huán)靶標(biāo)回收特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于構(gòu)建一對多的信號放大策略。然而目前的DNAzyme擴(kuò)增主要是線性擴(kuò)增模式，切割效率低下，成像靈敏度相對較低，無法滿足活細(xì)胞內(nèi)的低表達(dá)水平miRNA的原位成像分析。雖然許多研究者通過將DNAzyme與RCA,CHA,HCR等聯(lián)合使用以提高方法的擴(kuò)增效率，但是這些方法存在設(shè)計(jì)復(fù)雜、耗時、操作困難等缺陷且方法大多仍為簡單線性擴(kuò)增的級聯(lián)，擴(kuò)增效率仍然有待提高，發(fā)展更高擴(kuò)增效率的miRNA分析方法仍舊是一大挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明第一方面的目的，在于提供一組檢測核酸的DNAzyme探針。

本發(fā)明第二方面的目的，在于提供一種檢測核酸的納米顆粒。

本發(fā)明第三方面的目的，在于提供一種檢測核酸的納米顆粒的制備方法。

本發(fā)明第四方面的目的，在于提供一種檢測核酸的試劑盒。

本發(fā)明第五方面的目的，在于提供本發(fā)明第一方面的DNAzyme探針、本發(fā)明第二方面的納米顆粒、或第四方面的試劑盒在非疾病診斷用途的核酸檢測中的應(yīng)用。

本發(fā)明第六方面的目的，在于提供一種非疾病診斷用途的核酸檢測方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明的第一個方面，提供一組檢測核酸的DNAzyme探針，包含：酶鏈H1、底物鏈H2、酶鏈H3和底物鏈H4；

所述酶鏈H1從5’到3’依次包括：A序列、B序列、C序列、D序列和E序列；

所述E序列與目標(biāo)核酸互補(bǔ)；

所述D序列為TAG、AAG、ATG、TTG或GCG；優(yōu)選地，所述D序列為TAG；