[發明專利]一種鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條及其檢測方法

在審

• 申請號: 202110799515.2
• 申請日: 2021-07-15
• 公開（公告）號: CN113552346A
• 公開（公告）日: 2021-10-26
• 發明（設計）人: 李斌;吳有雪;吳美嬌;劉程;方水琴;田亞晨;劉濤;楊昊;劉箐
• 申請（專利權）人: 上海理工大學
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569;G01N33/558;G01N33/577;G01N33/543;G01N33/58
• 代理公司: 上海邦德專利代理事務所(普通合伙) 31312
• 代理人: 佘大鵬

1.一種鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，所述試紙條自一端至另一端依次設有樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；

所述硝酸纖維素膜上設有質控線和檢測線；所述檢測線靠近所述金標墊一端設置，所述質控線靠近所述吸水墊一端設置；

所述金標墊上設有與膠體金偶連的單克隆抗體，所述單克隆抗體由保藏號為D8的雜交瘤細胞株分泌產生；所述檢測線由保藏號為E8的雜交瘤細胞株分泌產生的單克隆抗體構成；所述質控線由羊抗鼠抗體構成。

2.根據權利要求1所述的鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，還包括一塊背襯，所述樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均承載于所述背襯上。

根據權利要求1所述的鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，在與膠體金偶連的單克隆抗體中，所述膠體金的粒徑為30～40nm，所述膠體金與單抗的質量體積比為3μg/mL。

3.根據權利要求1所述的鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，所述膠體金的最適pH確定如下：

取多組膠體金溶液，每組溶液中加入不同量的0.2mol/L碳酸鉀調整溶液調節所述膠體金溶液的pH，并且加入D8單克隆抗體進行反應，隨后加入10μL10％NaCl溶液持續反應，進行離心操作，離心后觀察到膠體金顏色最紅，無聚沉、無褪色或變色現象的該組膠體金溶液為膠體金的最適pH。

4.根據權利要求3所述的鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，D8單克隆抗體與膠體金偶聯的最佳結合量為：

取多組最適pH的膠體金溶液，每一組加入不同量的D8單克隆抗體，反應后，每一組均加入10μL 10％NaCl溶液，取顏色最紅且抗體用量最少的為最小結合量xμg/mL，為保證膠體金完全與D8單克隆抗體結合，以x+x×2為最佳結合量。

5.根據根據權利要求4所述的鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，與膠體金偶連的單克隆抗體制備如下：膠體金pH調節至最佳pH值，按D8單克隆抗體與膠體金偶聯的最佳結合量吸取抗體，以40μL/min滴加到膠體金溶液中，同時在磁力攪拌器上攪拌，待抗體加完后于4℃環境中持續攪拌1h，加入所述膠體金溶液1/10體積的含10％BSA的PB溶液，攪拌1h，移入離心管1000rpm離心10min，小心吸取上清至新離心管，將上清12000rpm離心10min，棄上清，沉淀用原膠體金溶液1/10體積的重懸液重懸，混合均勻后4℃保存備用。

6.一種鮑氏志賀氏菌的檢測方法，使用如權利要求1-5中任意一項所述的鮑氏志賀氏菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于，樣品滴在樣品墊上，順著金標墊、硝化纖維素膜和吸水紙的方向層析；

若樣品中含有目標細菌，目標細菌與金標墊上的膠體金偶聯的單克隆抗體結合，形成膠體金偶聯抗體—細菌復合物，所述復合物流經檢測線時，被檢測線的單克隆抗體所捕獲，形成膠體金偶聯單克隆抗體—細菌—捕獲抗體的三元復合物，使檢測線出現可視化的顏色；隨著繼續層析，復合物被質控線上的羊抗鼠抗體捕獲，質控線呈現可視化的顏色；

若樣品不含目標細菌，當樣品流經金標墊時，膠體金偶聯的單克隆抗體隨樣品層析，最終到達質控線，被質控線的羊抗鼠抗體捕獲，質控線呈現可視化的顏色，檢測線不顯示顏色。