[發(fā)明專利]基于核苷酸合成測序圖譜的微生物種群鑒定方法及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202110798061.7
• 申請日: 2021-07-15
• 公開（公告）號: CN113403372A
• 公開（公告）日: 2021-09-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳友菊;韋紅;萬逸
• 申請（專利權(quán)）人: 海南微氪生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6869
• 分類號: C12Q1/6869;C12Q1/04
• 代理公司: ?？谙柘鑼＠聞?wù)有限公司 46001
• 代理人: 莫臻

本發(fā)明涉及一種基于核苷酸合成測序圖譜的微生物種群鑒定方法及應(yīng)用。所述微生物種群鑒定方法，通過對微生物的目標片段進行三核苷酸和單核苷酸循環(huán)的測序反應(yīng)，得到測序圖譜，根據(jù)測序圖譜繪制比色帶，通過分析比色帶或/和測序圖譜確定微生物種類；所述三核苷酸為dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中的任意三種核苷酸；所述單核苷酸為不包括早三核苷酸中的另一核苷酸。本發(fā)明微生物種群鑒定方法縮短了檢測時間，且可通過分析比色帶或/和檢測圖譜，得出檢測結(jié)果，簡化了數(shù)據(jù)分析過程。本發(fā)明微生物種群鑒定方法的應(yīng)用還包括對定向突變位點的測序。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物種群鑒定的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于核苷酸合成測序圖譜的微生物種群鑒定方法。

背景技術(shù)

微生物種群鑒定測序是基于第二代高通量技術(shù)，通過有選擇的對微生物的16SrRNA/18SrRNA/ITS等基因序列進行測序，與基因文庫比較，鑒定微生物種群的技術(shù)。隨著微生物種群鑒定測序技術(shù)的不斷開發(fā)與精進，其在疾病預(yù)防和治療等領(lǐng)域的應(yīng)用也日益廣泛。尤其是在臨床中，快速、準確的鑒定病原微生物的種類，可加快診斷速度，方便醫(yī)生對病患進行針對性用藥治療。同時，這一方向的應(yīng)用也對微生物種群鑒定測序技術(shù)提出了更高的使用要求。

微生物種群鑒定測序的具體方法為：提取樣品中微生物總DNA，運用PCR技術(shù)擴增細菌基因組中的16SrDNA、真菌基因組中的18SrDNA或ITS區(qū)域，獲得絕大部分微生物16SrDNA、18SrDNA或ITS高可變區(qū)的擴增產(chǎn)物，并構(gòu)建擴增產(chǎn)物的文庫；然后，提取待測微生物的DNA，運用PCR技術(shù)進行擴增，利用測序平臺對擴增產(chǎn)物進行測序，通過將測序結(jié)果與基因文庫比較分析，鑒別微生物的種類。

目前，常用的基于PCR擴增技術(shù)來鑒定微生物種群的方法有Sanger測序和焦磷酸測序，這兩種方法準確性高，均通過將PCR產(chǎn)物的序列的堿基信息完全測定，與菌株的特征序列的堿基信息進行比對，來確定微生物種類。然而，在實際應(yīng)用中，也存在檢測過程冗長，檢測結(jié)果的分析過程繁瑣等問題，這大大限制了微生物種群鑒定測序在疾病診斷和治療上的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對上述問題，本發(fā)明的目的之一在于提供一種基于核苷酸合成測序圖譜的微生物種群鑒定方法，該鑒定方法檢測周期短，檢測準確度高，且分析過程簡單。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種基于核苷酸合成測序圖譜的微生物種群鑒定方法，通過對微生物的目標片段進行三核苷酸和單核苷酸循環(huán)的測序反應(yīng)，得到測序圖譜，根據(jù)測序圖譜繪制比色帶，通過分析比色帶或/和測序圖譜確定微生物種類；所述三核苷酸為dATPαS、dCTP、dTTP、dGTP中的任意三種核苷酸；所述單核苷酸為不包括在三核苷酸中的一固定核苷酸。

進一步的，具體包括以下步驟：(1)提取微生物的DNA模板，并在聚合酶的作用下PCR擴增部分可變區(qū)；(2)將擴增產(chǎn)物與測序引物結(jié)合；(3)交替循環(huán)加入三核苷酸和單核苷酸進行焦磷酸測序，得到測序圖譜；(4)根據(jù)測序圖譜繪制比色帶；(5)由比色帶或/和測序圖譜分析微生物種群。

進一步的，所述測序圖譜包括由核苷酸數(shù)目、核苷酸種類、信號強度以及三核苷酸和單核苷酸的位置排布構(gòu)成的全部信息。

進一步的，所述測序圖譜的分析方法包括：通過分析單核苷酸的位點確定微生物的種類。

進一步的，所述比色帶包括依次設(shè)置的若干單元，一單元對應(yīng)一核苷酸位點；所述三核苷酸所占單元位標記為區(qū)域A，所述單核苷酸所占單元位標記為區(qū)域B。

進一步的，比色帶的分析方法包括：將微生物的比色帶與相似比色帶疊加設(shè)置，根據(jù)重合程度確定微生物種類。

本發(fā)明基于核苷酸測序圖譜的微生物種群鑒定方法的有益效果為：