[發明專利]一種高通量定量和定性分析蛋白質的方法

在審

• 申請號: 202110794369.4
• 申請日: 2021-07-14
• 公開（公告）號: CN113484449A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 梅占龍;寧小蓮;李琪丹;劉杰;劉斯奇;任艷
• 申請（專利權）人: 深圳華大基因股份有限公司
• 主分類號: G01N30/06
• 分類號: G01N30/06;G01N30/88
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 閆書寧

本發明公開了一種高通量定量和定性分析蛋白質的方法，為同位素標記和數據非依賴采集兩者結合高通量定量和定性分析蛋白質。采用本發明提供的方法定量分析蛋白質，結果準確；適用于分析各種樣本類型(如血漿樣本、組織樣本)且無需細胞培養。本發明具有重要的應用價值。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種高通量定量和定性分析蛋白質的方法，尤其涉及結合同位素標記和數據非依賴采集的方法高通量定量和定性分析蛋白質。

背景技術

在蛋白質組學研究中，常用的質譜掃描方式有數據依賴采集(data-dependentacquisition，DDA)和數據非依賴采集(data-independent acquisition，DIA)兩種模式。DIA結合了DDA和選擇反應監測(Selected reaction monitoring，SRM)的特點，將整個掃描范圍等分為若干窗口，每個窗口依次選擇，碎裂，采集窗口內所有母離子的全部子離子的信息。所以，DIA能夠獲得掃描范圍內所有母離子及二級子離子信息，不會造成低豐度離子信息的丟失，同時突破了高分辨質譜二級定量的通量限制。與DDA相比，DIA具有更好的重現性、更高的靈敏度和更少的缺失值，在定量蛋白質組學中具有良好的應用。因此，DIA特別適用于復雜臨床樣本(如血漿、腦脊液)的大規模分析，因為這些樣本中含有大量動態變化的蛋白質。

隨著定量蛋白質組學不斷發展，高通量分析需求不斷增加，尤其是臨床樣本的大規模分析。當前DIA數據在質譜采集時間上，通常為血液樣本1針1小時，組織類樣本1針2小時。除去儀器的維護時間，一天僅僅能分析10個血液樣本或者5個組織樣本。較低的分析通量大大限制了大規模隊列研究的開展。提高蛋白分析的通量對大規模蛋白質組學分析的開展意義重大。

現有的提高DIA通量方法主要是基于質量虧損(NeuCode)的標簽與DIA耦合，一次可以平行分析多個樣品，從而提高通量。基于質量虧損的標簽，主要包括體內標志和體外標志。2015年，Joshua研究者將Neucode SILAC技術與DIA技術耦合起來，即NeuCoDIA技術，具體原理為將質量相差36mDa的重標1和重標2賴氨酸以10：1的比例分別培養細胞，培養一段時間后，提取蛋白，用賴氨酸消化酶進行消化；LC-MS/MS檢測時，進行DIA采集，分離窗口設置為27Th，因此相差36mDa的兩個峰保證在同一個分離窗口，可以進行共分離和共碎裂。保證了同一個肽段的兩個同位素峰產生的y離子同時出現在同一個MS2譜圖，進而可以進行相對定量分析。2017年，魯豪杰基于Neucode SILAC技術，通過對標簽進行一定修改后，與DIA技術耦合，實現了4標通量，稱為MdFDIA技術。MdFDIA技術的原理：賴氨酸重標和輕標分別培養細胞，然后用賴氨酸消化酶進行消化，得到的肽段再用甲醛進行二甲基化處理，由于甲醛分別用重標和輕標同位素進行標志，這樣得到了4種不同質量的肽段，質量差為5.8mDa；進行DIA采集，分離窗口設置為27Th，因此相差5.8mDa的兩個峰保證在同一個分離窗口；可以進行共分離和共碎裂；保證了同一個肽段的兩個同位素峰產生的y離子同時出現在同一個MS2譜圖，進而可以進行相對定量分析。NeuCoDIA技術和MdFDIA技術都是通過代謝途徑(細胞培養)對肽段的賴氨酸進行標記來實現通量提升，對于不適合細胞培養的則不適用。同時，嵌入賴氨酸同位素的標記需要特定的Lys-c消化酶酶切產生含有賴氨酸殘基的片段用于定量，這導致與胰蛋白酶酶切相比，鑒定的蛋白數量減少。

發明內容

本發明的目的是高通量定量和定性分析蛋白質。

本發明首先保護一種高通量分析蛋白質的方法，可包括如下步驟：

(1)分別提取若干目標樣本的蛋白，之后酶解，獲得酶解肽段；

(2)完成步驟(1)后，分別用質量數相差大于50Da的標簽標記來自不同樣本的肽段；

(3)將步驟(2)標記的肽段進行LC-MS/MS檢測，采用DDA模式采集數據，構建DDA譜圖數據庫；