[發明專利]一種重組人BNP蛋白及其應用

在審

• 申請號: 202110792534.2
• 申請日: 2021-07-14
• 公開（公告）號: CN113278059A
• 公開（公告）日: 2021-08-20
• 發明（設計）人: 羅奇斌;任毅;廖勝光;申玉林
• 申請（專利權）人: 天津奇云諾德生物醫學有限公司
• 主分類號: C07K14/58
• 分類號: C07K14/58;C07K19/00;C12N15/16;C12N15/70;G01N33/74
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種重組人BNP蛋白，所述的重組人BNP蛋白多肽的氨基酸序列為SEQ ID NO：1。

2.一種編碼權利要求1所述的重組人BNP蛋白的基因，其特征在于所述重組人BNP蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO：2。

3.一種如權利要求1所述的重組人BNP蛋白的制備方法，其特征在于所述制備方法包含以下步驟：

（1）根據GENEBANK中提供的BNP成熟蛋白序列，獲得BNP的成熟蛋白編碼氨基酸及核苷酸序列，因為后續需要在大腸桿菌感受態細胞進行培養，所以根據大腸桿菌的密碼子使用偏好，對其進行同義改造，獲得改造好的BNP成熟蛋白核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，其氨基酸編碼序列如SEQ ID NO：4所示；

（2）用人工合成的方法按照“改造后BNP序列-接頭序列-人工XTEN序列”合成重組BNP-XTEN融合序列，并在融合序列的5’端引入BamH I限制性內切酶位點以及保護堿基，在融合序列的3’端引入Xho I限制性內切酶位點以及保護堿基，得到最終重組BNP-XTEN融合序列，其核苷酸編碼序列為SEQ ID NO：2所示，其對應的氨基酸編碼序列，如SEQ ID NO：1所示；

（3）對（2）中得到的重組BNP-XTEN融合序列以及PGEX-6P載體質粒進行雙酶切反應，然后用連接酶進行連接反應，得到重組PGEX-BNP-XTEN融合質粒序列；

（4）將（3）中得到的重組PGEX-BNP-XTEN融合質粒轉入BL21(DE3)感受態細胞并根據要求進行篩選，得到目的融合質粒陽性克隆；

（5）將（4）中篩選得到的重組PGEX-BNP-XTEN融合質粒陽性克隆擴大培養，獲得表達的重組PGEX-BNP-XTEN融合蛋白，并進行重組PGEX-BNP-XTEN融合蛋白的表達鑒定；

（6）對（5）所得的重組PGEX-BNP-XTEN融合蛋白進行純化，并計算其純度值和濃度值；

（7）對（6）所得的重組PGEX-BNP-XTEN融合蛋白進行活性檢測；

（8）對（6）所得的重組PGEX-BNP-XTEN融合蛋白進行穩定性檢測。

4.根據權利要求3所述的重組人BNP蛋白的制備方法，其特征在于所述的蛋白重組融合質粒的通過是否含有氨芐青霉素抗性來進行篩選。

5.根據權利要求3所述的重組人BNP蛋白的制備方法，其特征在于所述的蛋白純化采用親和層析法及疏水層析法純化重組PGEX-BNP-XTEN蛋白。

6.根據權利要求3所述的重組人BNP蛋白的制備方法，其特征在于所述的活性檢測采用離體動脈條測定法檢測重組PGEX-BNP-XTEN融合蛋白體外活性。

7.根據權利要求3所述的重組人BNP蛋白的制備方法，其特征在于所述的穩定性檢測采用ELISA試劑盒測定各時間點血漿中BNP含量。

8.根據權利要求1所述的重組人BNP蛋白，其特征在于所述的重組人BNP蛋白可用于后續BNP相關產品的進一步開發，如相關BNP檢測試劑盒標準品的開發，或者制備急性心衰的藥物。