[發明專利]一種腺相關病毒跨越血腦屏障模型的構建方法

在審

• 申請號: 202110791120.8
• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113583939A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 劉丹;朱明洋;刁勇;黃若蘭;王琨
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/079
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

本發明公開一種腺相關病毒跨越血腦屏障模型的構建方法，包括以下步驟：將配置好的星形膠質細胞接種于芯片上層；將配置好的人腦微血管內皮細胞倒置接種于芯片下層；將芯片置于配套的精密搖床以此來模擬人體血管內的流體剪切力；對所述雙層共培養芯片進行連續培養以使腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞生長至血腦屏障結構形成。本發明提供的技術方案，成功構建了體外血腦屏障模型，更準確、更接近的反應了體內血腦屏障的特征，可以用于AAV跨越血腦屏障的相關研究。本發明添加流體剪切力，更符合體內真實環境，且可實現高通量、減少細胞和試劑的消耗量。

技術領域

本發明涉及生物工程領域，特別涉及體外雙層細胞動態共培養構建血腦屏障模型以及使用該模型進行腺相關病毒跨越血腦屏障相關研究。

背景技術

中樞神經系統疾病是最難治療的疾病之一，其相關的致殘率很高，通常難以完全治愈，治療困難的主要原因是因為血腦屏障(blood-brain-barrier，BBB)的存在。血腦屏障是一種選擇性滲透屏障，其選擇性地限制或阻斷許多親水分子或大分子的透過。因此，血腦屏障在保護腦組織的同時也限制了許多治療藥物的輸送，嚴重影響治療效果。

腺相關病毒(Adeno-associated virus，AAV)作為載體已成為基因治療的重要組成部分，因為它無毒、免疫原性低、可在體內持續表達。AAV載體的特性使其成為基因治療中樞神經系統疾病的候選基因載體。目前發現的AAV載體血清型中僅有少數幾類如AAV9、AAVrh10等，可以跨過血腦屏障進入神經端，但其為全身轉導型，不具有靶向性，因此跨越效率不高，治療效果受限，且跨越機理尚不明確。

建立高保真血腦屏障模型對血腦屏障功能研究以及對AAV跨越血腦屏障的相關研究具有重要意義。目前血腦屏障模型分為體內模型和體外模型兩大類。體內模型直接利用整個活體生物，其優勢在于可以反映BBB環境的復雜性，但體內模型存在成本高、實驗周期長、倫理問題等缺點。體外模型具有成本低、簡單易控、模型相對穩定、適合高通量篩選的特點。體外血腦屏障模型多建立在靜態二維培養系統中，但該模型無法復制BBB的剪切力等關鍵特征。

發明內容

本發明旨在提供一種體外動態雙層共培養構建血腦屏障模型的方法，該模型可用于腺相關病毒跨越血腦屏障的相關研究。

具體的，本發明實現上述目的的具體方案如下：

一種腺相關病毒跨越血腦屏障模型的構建方法，所述的方法包括以下步驟：

1)使用一芯片，所述的芯片設有上腔室以及下腔室，上腔室和下腔室之間采用多孔濾膜隔開，所述的多孔濾膜孔徑小于待培養細胞直徑，厚度5-20μm；腦微血管內皮細胞培養于下腔室內，星形膠質細胞培養于上腔室內；

2)芯片預處理：將鼠尾膠原溶液注入器官芯片上腔室和下腔室；

3)細胞接種與培養：將星形膠質細胞消化后調整至適宜濃度，接種于芯片上腔室，靜置于培養箱1-3h后向芯片內補充星形膠質細胞培養基；每隔20-25h換液一次；

將腦微血管內皮細胞消化后調整至適宜濃度，接種于芯片下腔室，倒置于培養箱使其貼附于多孔濾膜界面上，1.5-2.5h后翻轉芯片，向芯片內補充DMEM高糖培養基；

將芯片置于配套精密搖床上連續動態培養，芯片在向上和向下分別和水平面呈30度角的范圍內上下擺動)，1-3circle/min，通過重力作用驅動流體流動，實現無泵、連續恒定灌流，每隔20-25h換液一次，

4)使腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞生長至屏障形成，即對應生成模擬的血腦屏障；；

5)將腺相關病毒加入，研究腺相關病毒跨越血腦屏障特性。

優選地，在研究腺相關病毒跨越血腦屏障效率和機制需多個實驗組時，該芯片可達到240組實驗同步進行；