[發明專利]一種腺相關病毒跨越血腦屏障模型的構建方法

在審

• 申請號: 202110791120.8
• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113583939A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發明（設計）人: 劉丹;朱明洋;刁勇;黃若蘭;王琨
• 申請（專利權）人: 華僑大學
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/079
• 代理公司: 廈門市首創君合專利事務所有限公司 35204
• 代理人: 張松亭;游學明

1.一種腺相關病毒跨越血腦屏障模型的構建方法，所述的方法包括以下步驟：

1)使用一芯片，所述的芯片設有上腔室以及下腔室，上腔室和下腔室之間采用多孔濾膜隔開，所述的多孔濾膜孔徑小于待培養細胞直徑，厚度5-20μm；腦微血管內皮細胞培養于下腔室內，星形膠質細胞培養于上腔室內；

2)芯片預處理：將鼠尾膠原溶液注入器官芯片上腔室和下腔室；

3)細胞接種與培養：將星形膠質細胞消化后調整至適宜濃度，接種于芯片上腔室，靜置于培養箱1-3h后向芯片內補充星形膠質細胞培養基；

將芯片置于配套精密搖床上動態培養45-55h，每隔20-25h換液一次；

將腦微血管內皮細胞消化后調整至適宜濃度，接種于芯片下腔室，倒置于培養箱使其貼附于多孔濾膜界面上，1.5-2.5h后翻轉芯片，向芯片內補充DMEM高糖培養基；

將芯片置于配套精密搖床上連續動態培養，芯片在向上和向下分別和水平面呈30度角的范圍內上下擺動，1-3轉/min，通過重力作用驅動流體流動，實現無泵、連續恒定灌流；每隔20-25h換液一次；

4)腦微血管內皮細胞和星形膠質細胞生長至屏障形成，即對應生成模擬的血腦屏障；

5)將腺相關病毒加入，研究腺相關病毒跨越血腦屏障特性。

2.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，所述的星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞來源于人類細胞。

3.如權利要求1或2所述的構建方法，其特征在于，所述腦微血管內皮細胞為永生化腦微血管內皮細胞(HCMEC/D3)、腦微血管內皮細胞(HBMEC)或從人多能干細胞(ips)誘導分化而來的細胞中的至少一種。

4.如權利要求1所述的構建方法，其特征在于，將星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞配制成對應細胞懸液步驟中：

將星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞分別使用星形膠質細胞培養基和DMEM高糖培養基進行復蘇培養，當細胞融合度達到80-90％時，分別消化星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞，對應獲得星形膠質細胞和腦微血管內皮細胞懸液，其中：

所述復蘇培養條件為：培養溫度37℃、CO₂濃度5％、培養濕度95％。

5.如權利要求4所述的構建方法，其特征在于，

所述星形膠質細胞懸液濃度為2.5×10⁶cells/mL，注入量為每孔10μL；

所述腦微血管內皮細胞消化后調整懸液濃度為1×10⁷cells/mL，注入量為每孔10μL。

6.如權利要求1中所述的構建方法，其特征在于，步驟4)中，待細胞生長良好，屏障功能形成進行步驟5)之前，先對模型屏障功能表進行表征。

7.如權利要求6中所述的構建方法，其特征在于，表征過程如下：

跨膜電阻值，使用細胞電阻儀從模型構建第一天開始每隔24h對其電阻值進行一次測定；

免疫熒光，常規免疫熒光染色操作，ZO-1免疫染色，表征血腦屏障緊密連接情況；

小分子滲透，使用小分子熒光物質，分析小分子物質的滲透性，表征血腦屏障模型的滲透性。

8.如權利要求1中所述的構建方法，其特征在于，步驟5)中，過程如下：

分析各血清型腺相關病毒跨越血腦屏障效率，將各血清型腺相關病毒加入芯片下腔室，上腔室補充DMEM高糖培養基；

各種血清型腺相關病毒濃度為1×10¹⁰GC/mL，每孔加入量為200μL，上腔室補充DMEM高糖培養基100μL；

在定期從器官芯片上腔室取樣，同時補充DMEM高糖培養基，用實時熒光定量PCR(qPCR)對樣品進行測定，分析各類AAV的跨越效率。

9.如權利要求8中所述的構建方法，其特征在于，所述各種血清型腺相關病毒為2型腺相關病毒(AAV2)、9型腺相關病毒(AAV9)以及重組腺相關病毒AAV-PHP.eB。

10.如權利要求8中所述的構建方法，其特征在于，所述的定期為在12h、24h、36h、48h從芯片上腔室中取樣。