[發明專利]檢測非洲豬瘟病毒衣殼完整性的PCR引物、探針、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202110790800.8
• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113462817A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 王印;邵靚;陳弟詩;楊悅;陳斌;張鵬飛;江地科;陳婉婷;涂藤;龐茂楠;羅燕;楊澤曉;姚學萍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學;四川省動物疫病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6851;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 重慶樂泰知識產權代理事務所(普通合伙) 50221
• 代理人: 鄧鵬

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種完整衣殼結構的非洲豬瘟病毒檢測。針對現有檢測ASFV的方法中，能夠鑒別感染性ASFV的檢測方法最低檢出限為10copies/μl，靈敏度還不夠高的問題，本發明提供了一種檢測非洲豬瘟病毒衣殼完整性的PCR引物和探針，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，所述探針的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。本發明的檢測試劑盒檢測結果準確可靠、操作簡便，可用于規模化養殖場、實驗室及疫病防控單位，對于實際生產中的非洲豬瘟防控具有重要意義。

技術領域

本發明涉及生物檢測技術領域，尤其涉及一種完整衣殼結構的非洲豬瘟病毒檢測。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的一種豬急性熱性高度接觸性傳染病，臨床癥狀與豬瘟相似，主要表現為發熱，皮膚發紺和淋巴結、腎臟、胃腸道出血等。強毒株可引起豬的高死亡率，達90％以上。目前，對于該病暫無有效的疫苗和藥物進行防控，最有效的防控措施為檢疫，而養殖場層面的非洲豬瘟防控是一項基于生物安全的系統工程。因此，提升我國養殖場生物安全水平，清除已存在的ASFV并有效阻止ASFV再次進入養殖場迫在眉睫。

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qPCR)是1996年由美國AppliedBiosystems公司推出的一種新定量試驗技術，它是通過熒光染料或熒光標記的特異性的探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟件可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度。2019年1月4日，中國農業農村部公布了第一批ASFV現場快速檢測試劑，其中60％以上都是運用實時qPCR檢測方法。該方法能實時檢測反應過程，測定模板的絕對量，特異性強等優點使得qPCR在實際排查ASFV上，有更高的利用價值。但qPCR檢測結果大于閾值僅表明樣品中存在靶核酸片段，并不能反映出靶片段來源于游離核酸或是完整病毒，無法判斷樣品是否含有感染性病毒。對于確定具有臨床癥狀處于發病期豬只樣品中是否含有感染性病毒無指導意義，但對于環境樣品，特別是復養時確定陽性樣品中是否具有完整衣殼的病毒，這是評價該場是否重新啟用的先決條件之一。

現有存在的非洲豬瘟病毒檢測方法多種多樣，比如普通PCR方法、熒光PCR方法、熒光RAA方法、高敏熒光免疫分析法、夾心Elisa抗原檢測方法、間接Elisa抗體檢測方法、阻斷Elisa抗體檢測方法、夾心Elisa抗體檢測方法、間接免疫熒光方法等，但這些檢測方法均只能檢測病毒核酸是否存在，不能判斷病毒衣殼是否完整，是否具有感染性。如果要確定病毒是否具有感染性，則需進行細胞實驗或動物實驗，但該實驗操作繁瑣，容易被受體細胞或受體動物個體差異影響。在檢測消毒液殺滅率的實驗、舊場復養的環境檢測實驗、市場流動帶毒豬肉是否具有感染性實驗等多個方面均需要檢測病毒是否具有感染性，目前存在的技術均不能達到實驗要求。現有檢測技術能夠檢出感染性病毒，探針、引物序列的靈敏度能達到最低檢測限為10copies/μl，檢測靈敏度尚不能達到一定下限，不能滿足某些檢測項目的檢出要求。

PMA-PCR技術，又稱活力PCR(Viability PCR,vPCR)，可以用于檢測細菌或病毒是否具有完整結構，可用于病毒理化特性研究、篩選消毒劑品類與最佳作用條件、評價生物安全措施效果，同時在檢測過程中排除了游離核酸對結果的干擾，在ASFV的防控中具有極大的應用潛能。其技術原理建立在PMA的作用機理之上，疊氮溴化丙錠(Propidiummonoazide，PMA)是一種疊氮類核酸染料，對核酸具有高度親和力，該物質能夠進入病毒衣殼(脂蛋白)破損的非活性病毒內部，在強光作用下，所帶的光敏性疊氮基團轉化為高活性的氮賓自由基，并與結合位點附近的任意碳氫化合物反應形成穩定的共價氮碳鍵，致使核酸分子的永久修飾，最后阻斷核酸分子的擴增，如此便消除了非活性病毒核酸對檢測結果的影響；同時，由于活性病毒具有完整的衣殼，PMA被阻隔在病毒之外，故不能阻斷活性病毒核酸分子的擴增。此外，駐留在溶液中沒有與核酸分子進行交聯的PMA在強光照射的同時與水分子反應生成沒有活性的羥胺。