[發(fā)明專(zhuān)利]用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物及應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110790773.4
• 申請(qǐng)日: 2021-07-13
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113621711B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陶敏;黃強(qiáng);李紅濤;湯婷;陳仁峰;張宏;劉長(zhǎng)明;彭海波;楊俊鋒;李想;宋江騰
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢中科瑞華生態(tài)科技股份有限公司;四川省能投攀枝花水電開(kāi)發(fā)有限公司;湖北省長(zhǎng)江水生態(tài)保護(hù)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 余曉雪

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR體系及應(yīng)用，屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供了4組鳙微衛(wèi)星標(biāo)記的雙重PCR反應(yīng)體系。利用本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)對(duì)鳙群體的遺傳多樣性分析，繼而確定個(gè)體之間的親緣關(guān)系，避免了群體之間近親繁殖。本發(fā)明的擴(kuò)增結(jié)果具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，并且本發(fā)明所消耗的財(cái)力和人力都比傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)減少了一半，具有巨大的實(shí)用價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及一種雙重PCR微衛(wèi)星引物及應(yīng)用，尤其涉及一種用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物及應(yīng)用。

背景技術(shù)

鳙(學(xué)名：Aristichthys?nobilis)俗稱(chēng)花鰱、胖頭魚(yú)、包頭魚(yú)、大頭魚(yú)、黑鰱、麻鰱、雄魚(yú)，是中國(guó)特有淡水魚(yú)類(lèi)，也是中國(guó)四大家魚(yú)之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。鳙的外形似鰱魚(yú)，體型側(cè)扁，頭部較大且寬，口也寬大，且稍微上翹，眼位比較低。鳙生長(zhǎng)在淡水湖泊、河流、水庫(kù)、池塘里，喜棲居在水域的中上層。鳙是江湖洄游性魚(yú)類(lèi)，親魚(yú)性成熟時(shí)到江中產(chǎn)卵，產(chǎn)卵后仔稚魚(yú)隨水流進(jìn)入沿江湖泊攝食肥育；待冬季湖泊水位回落時(shí)，又回到江河的深水區(qū)越冬。鳙產(chǎn)漂流性卵，性成熟為4～5齡，雄魚(yú)最小為3齡，繁殖期在4～7月；喜在降雨天氣，江水水位陡然上漲，水體流速明顯加快時(shí)進(jìn)行產(chǎn)卵。鳙人工繁育的催產(chǎn)季節(jié)多在5月初至6月中旬，一般3公斤以上的雌魚(yú)便可達(dá)到性成熟。5公斤左右的雌魚(yú)相對(duì)懷卵量約4～5萬(wàn)粒/千克，絕對(duì)懷卵量20～25萬(wàn)粒，產(chǎn)卵期與草魚(yú)相近。在天然河流和湖泊等水體中，通常可見(jiàn)到10千克以上的個(gè)體，最大者可達(dá)50千克。在飼料充足的條件下，池塘養(yǎng)殖1齡魚(yú)可重達(dá)0.8～1千克。初次性成熟個(gè)體體重大，部分地區(qū)達(dá)10千克以上，但在廣西、廣東地區(qū)，不足10千克的個(gè)體通常也可產(chǎn)卵。

微衛(wèi)星標(biāo)記是目前研究動(dòng)物保護(hù)遺傳學(xué)中最理想的一類(lèi)方式，微衛(wèi)星具有多態(tài)性高、共顯性遺傳、遍布整個(gè)基因組等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)物遺傳性研究。微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR是在同一PCR反應(yīng)體系里加上二對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。多重PCR具有高效性、系統(tǒng)性、經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便性等優(yōu)點(diǎn)。有關(guān)鳙的微衛(wèi)星標(biāo)記多重PCR國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決背景技術(shù)中存在的上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種為鳙的選育工作提供了重要的研究基礎(chǔ)且具有顯著的推廣價(jià)值的用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物及應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物，其特征在于：所述用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物包括如下4組引物序列：

一種基于如前所述的用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物對(duì)鳙遺傳多樣性進(jìn)行分析的方法，所述方法包括如下步驟：

1)取鳙組織樣品并從鳙組織樣品中提取鳙樣品DNA；

2)利用如前所述的用于鳙遺傳多樣性分析的雙重PCR微衛(wèi)星引物對(duì)鳙樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；

3)把步驟2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在10％的聚丙烯酰胺凝膠上進(jìn)行電泳分離，根據(jù)分離結(jié)果統(tǒng)計(jì)每個(gè)個(gè)體在所有微衛(wèi)星位點(diǎn)中PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的基因型，根據(jù)各個(gè)個(gè)體的基因分型結(jié)果進(jìn)行遺傳多樣性分析。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的步驟2)中的PCR反應(yīng)體系是25ul：10×PCR?Buffer2.5ul，2.5mmol/L?dNTP?0.5ul，2mmol/L?MgCl₂?1.5ul，Taq酶0.4ul，DNA模板3ul，超純水13.1ul以及每組反應(yīng)體系兩對(duì)引物的上下游引物各1ul。

作為優(yōu)選，本發(fā)明所采用的步驟2)中的PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性3min；95℃變性30s，退火溫度57℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存。