[發(fā)明專利]一種基于自組裝的表面展示氟化酶的方法

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• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號(hào): CN113355343A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周景文;楊文涵;余世琴;堵國成;陳堅(jiān)
• 申請（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/70
• 分類號(hào): C12N15/70;C12N15/62;C12N1/21;C12N9/10;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 趙巧娜

本發(fā)明公開了一種基于自組裝的表面展示氟化酶的方法，屬于基因和生物工程領(lǐng)域。本發(fā)明通過模塊化的方法，將靶蛋白與載體蛋白獨(dú)立表達(dá)，通過翻譯后原位組裝即可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜蛋白的表面展示。本發(fā)明所使用的SC?ST系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了六亞基結(jié)構(gòu)氟化酶在大腸桿菌表面的展示，避免了復(fù)雜的純化步驟，可以提高下游分離純化的效率并節(jié)省成本。有利于實(shí)現(xiàn)氟化酶在工業(yè)化生產(chǎn)中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于自組裝的表面展示氟化酶的方法，屬于基因和生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

氟元素(F，元素周期第9)，在地球上所有元素中天然存在的比值排名第24位，在地殼中的鹵素元素中天然存在比值排名最高，然而以可溶性氟離子的存在形式卻較為稀有。氟元素在水溶液中極易被溶劑化從而導(dǎo)致其生物活性大大降低，與其他鹵素相比，很難經(jīng)過鹵素過氧化物酶氧化進(jìn)而生成高附加值的有機(jī)物。這使得氟元素的生物利用收到極大的限制。雖然天然的氟化有機(jī)物十分稀有，但氟化物的價(jià)值卻十分巨大。有機(jī)氟化物可以被廣泛的應(yīng)用于生物有機(jī)化學(xué)，藥物化學(xué)和生物材料等領(lǐng)域，尤其在醫(yī)藥領(lǐng)域，氟元素的引入能夠顯增強(qiáng)藥物活性。據(jù)統(tǒng)計(jì)，最暢銷藥物的藥物例如氟化可的松、諾氟沙星、蘭索拉唑等，30％的藥品中含有氟元素。目前在化合物中引入氟元素主要依靠化學(xué)合成的方法，但其難以實(shí)現(xiàn)C-F鍵的選擇性引入，并且存在反應(yīng)條件劇烈、底物毒性大、能耗高、產(chǎn)率低等不足。生物法依靠氟化酶來合成有機(jī)氟化物，其能夠?qū)崿F(xiàn)特定C-F鍵的合成，并且反應(yīng)溫和、底物廉價(jià)、環(huán)保等特性使其在氟化天然產(chǎn)物的合成研究中已發(fā)揮越來越重要的作用。

表面展示技術(shù)是將靶蛋白的基因序列與載體蛋白的基因序列連接后導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)，載體蛋白與靶蛋白融合表達(dá)，并將靶蛋白定位于宿主細(xì)胞的表面從而實(shí)現(xiàn)靶蛋白的表面展示，外源蛋白的這種錨定有如下優(yōu)勢：1、可以使得特定的反應(yīng)在細(xì)胞表面直接發(fā)生而提高反應(yīng)效率；2、能克服某些大分子底物不能穿越細(xì)胞進(jìn)入胞內(nèi)的問題；3、克服某些反應(yīng)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行特定的構(gòu)型折疊等弊端；4、簡化產(chǎn)物的提取純化過程。因而受到越來越多的關(guān)注，目前研究較多的經(jīng)典載體蛋白有冰核蛋白(ice nucleationprotein,INP)、自轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Autotransporter)、S-蛋白，OmpA、LamB、OmpC、OmpX和OmpS等多種以及脂蛋白與外膜蛋白鑲嵌的Lpp-OmpA等。但傳統(tǒng)的基因融合方式對所展示的蛋白大小和復(fù)雜程度有限制，另外靶錯(cuò)誤定位，靶蛋白與載體蛋白表達(dá)互相干擾可能導(dǎo)致蛋白失活甚至降解等問題。氟化酶具有復(fù)雜的六亞基結(jié)構(gòu)，傳統(tǒng)表面展示的方法可能會(huì)造成酶催化活性喪失。因此，急需開發(fā)一種新型表面展示技術(shù)，能表面展示氟化酶等具有復(fù)雜的六亞基結(jié)構(gòu)的蛋白新技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于在現(xiàn)有技術(shù)中無法很好地將氟化酶進(jìn)行表面展示，限制了氟化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供了一種自組裝表面展示的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)由質(zhì)粒A和質(zhì)粒B組成。

在一種實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒A上表達(dá)錨定蛋白和SpyCatcher。

在一種實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒B上表達(dá)目的蛋白和SpyTag。

在一種實(shí)施方式中，所述錨定蛋白包括Lpp-OmpA。

在一種實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒A上還含有鼠李糖誘導(dǎo)型啟動(dòng)子；所述質(zhì)粒A上的RBS序列如SEQ ID NO.1所示。

在一種實(shí)施方式中，所述質(zhì)粒A上的RBS的序列如SEQ ID NO.1所示。

在一種實(shí)施方式中，所述Lpp-OmpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

在一種實(shí)施方式中，所述SpyCatcher的核苷酸列如SEQ ID NO.4所示。

在一種實(shí)施方式中，所述SpyTag的核苷酸列如SEQ ID NO.5所示。

在一種實(shí)施方式中，質(zhì)粒A為pSQ036-TF-LP-SC，所述質(zhì)粒B為pSQ051。