[發(fā)明專利]一種用于人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110787339.0
• 申請日: 2021-07-13
• 公開（公告）號: CN113238062B
• 公開（公告）日: 2021-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉丹;陳立波
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南菲思特精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/577;G01N33/531;G01N33/58;G01N21/76
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本發(fā)明屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（VASP?P）光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測試劑盒及其檢測方法，其中，所述試劑盒包括組份SA?GG、組份Bio?Ab、組份FG?Ab、樣本前處理緩沖液、含PGE1的樣本激活劑和含PGE1+ADP的樣本抑制劑。本發(fā)明的試劑盒采用均相免疫，利用光激化學(xué)發(fā)光分析方法與光激化學(xué)發(fā)光檢測儀配合，用于測定人體樣本中的人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白含量，與目前VASP檢測主流技術(shù)流式細(xì)胞技術(shù)相比，對操作人員要求較為簡單及儀器費(fèi)用較低，與ELISA等非均相免疫分析相比，檢測范圍寬，操作簡單，檢測時間短，靈敏度高，重復(fù)性好。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測試劑盒及其檢測方法，屬于分子免疫學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白（VASP）屬于Ena/VASP蛋白家族，是一種血小板胞內(nèi)肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白。其存在2個重要的磷酸化位點(diǎn)，分別為：絲氨酸157和絲氨酸239，這兩個磷酸化位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)與血小板的活化功能密切相關(guān)。絲氨酸157磷酸化位點(diǎn)的磷酸化可以抑制人血小板中纖維蛋白原與糖蛋白IIb/IIIa的結(jié)合；絲氨酸239磷酸化位點(diǎn)主要存在于完整的人內(nèi)皮細(xì)胞及血小板上，其磷酸化以應(yīng)答藥理和生理的血管舒張劑和血小板抑制劑。血管舒張刺激磷蛋白是血小板內(nèi)P2Y12受體特異性活化標(biāo)志物，抑制其磷酸化；當(dāng)存在ADP受體拮抗劑時，VASP磷酸化產(chǎn)物增多，進(jìn)而抑制血小板的活化。

氯吡格雷對血小板的抑制作用主要通過特異性阻斷ADP與血小板膜上P2Y12受體結(jié)合而起效，P2Y12受體被抑制則血管舒張刺激磷蛋白磷酸化，表現(xiàn)為血小板抑制；去磷酸化則血小板活性恢復(fù)。血管舒張刺激磷蛋白磷酸化是P2Y12活化途徑的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對其量化分析是針對P2Y12通路的特異性檢測方法，且測量結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性，量化檢測血管舒張刺激磷蛋白的磷酸化水平可特異性地評價(jià)氯吡格雷對血小板的抑制程度。

目前VASP檢測主流產(chǎn)品為stago公司的PLT VASP/P2Y12，需要采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，流式細(xì)胞技術(shù)和操作對人員和機(jī)器的要求較高導(dǎo)致花費(fèi)較為昂貴、Stago公司也提供檢測VASP的試劑盒，但反應(yīng)時間較長，操作繁瑣。

而文獻(xiàn)中也公開了一些VASP的新的檢測方法，中國專利CN106370839A公開了一種快速檢測的量子點(diǎn)免疫層析試紙條。試紙條將磷酸化VASP單克隆抗體和量子點(diǎn)偶聯(lián)物噴涂在玻璃纖維素膜上得到探針固定墊，VASP單克隆抗體包被在檢測膜檢測線上，羊抗鼠多克隆抗體包被在檢測膜的質(zhì)控線上。

CN108982861A公開了一種酶促化學(xué)發(fā)光血管擴(kuò)張型刺激磷蛋白檢測試劑盒。用包被有VASP單克隆抗體的磁顆粒和辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記VASP-P抗體Ⅱ，在與待測標(biāo)本中相應(yīng)的抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成固相包被抗體-待測抗原-酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，經(jīng)洗滌后，加入底物（發(fā)光劑），酶催化和分解底物發(fā)光。

以上三種發(fā)光免疫分析方法，均屬于非均相免疫分析。非均相免疫分析在檢測信號前，需要通過反復(fù)洗滌固相(微粒)，以分離去除分布于液相中的未參加反應(yīng)的標(biāo)記抗體。多次洗滌必然會為免疫分析帶來洗滌“誤差”，影響分析方法的精密度，從而影響分析方法的準(zhǔn)確度和分析敏感度。并且反復(fù)洗滌與檢測周期、檢測成本都有較為直接的關(guān)系，因此，設(shè)計(jì)一種均相的免疫分析法用于VASP的檢測，是十分有必要的。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的上述問題，本發(fā)明的目的是獲得用于人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測試劑盒及其檢測方法，避免了酶聯(lián)免疫試劑盒存在的線性范圍窄、操作繁瑣等缺點(diǎn)，且解決了靈敏度低、穩(wěn)定性差等缺陷。

為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的之一，本發(fā)明采用的人磷酸化血管擴(kuò)張刺激磷蛋白光激化學(xué)發(fā)光均相免疫檢測試劑盒的技術(shù)方案如下：