[發明專利]一種能夠在煙草中進行高效基因編輯的載體及其應用

有效

• 申請號: 202110786304.5
• 申請日: 2021-07-12
• 公開（公告）號: CN113667689B
• 公開（公告）日: 2023-04-11
• 發明（設計）人: 代常波;呂婧;孫玉合;李冰潔;王李先秋
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院煙草研究所(中國煙草總公司青州煙草研究所)
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/84;C12N15/55;C12N15/113
• 代理公司: 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超

本公開涉及一種能夠在煙草中進行高效基因編輯的載體，所述載體中依次插入有35Spro啟動子、gRNA插入區、eu終止子、鈣網蛋白啟動子元件、spCas9蛋白表達元件、ubp終止子和潮霉素篩選標記。所述載體為pDC45載體系統，其能顯著提升煙草的基因編輯效率，并且能夠大大提高多靶點、純合/雙等位的編輯效率，為高通量創制植物全基因組編輯株系奠定基礎。

技術領域

本公開涉及基因工程領域，具體地，涉及一種能夠在煙草中進行高效基因編輯的載體及其應用。

背景技術

基因組編輯技術是一類對物種基因組進行定向改變的現代生物技術，因其具有修飾效率高、特異性強、無物種限制等特點，得到了廣泛的關注和應用。最早開發利用的基因編輯技術是鋅指核酸酶(zinc?finger?nucleases,ZFN)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription?activator-like?effector?nucleases，TALEN)，雖然能實現不同物種的基因組修飾，但存在設計復雜、工作量大、效率低、費用昂貴等缺點。CRISPR-Cas技術是最新的3代基因編輯技術，由成簇且有規律間隔的回文重復序列和CRISPR核酸酶蛋白Cas構成，是古細菌在進化中形成的一種獲得性自我免疫防御體系(Ishino?Y,1987)。CRISPR-Cas系統因其設計操縱簡便、編輯高效、精確與沒有物種特異性等優勢而被廣泛應用于動、植物及微生物基因功能解析、新種質創制及遺傳改良。

近年來，利用II型CRISPR-Cas9系統，在水稻、玉米、擬南芥、西紅柿等植物中實現了基因組定向編輯。盡管科學家在小麥、煙草等多倍體植物中也實現的基因編輯，但由于多倍體植物必須，必須同時敲出1個基因的多個拷貝才能實現該基因在特定發育過程中作用，比如，同時敲除小麥A、B和D基因組的MLO基因才能獲得小麥抗白粉病的特性(Wang?el?al，2014，Nature?biotech)。煙草是多倍體研究的重要模式植物，在代謝、抗體生產、外源蛋白表達等方面具有重要的作用。2015年，Gao等人首次在栽培煙草中實現了基因編輯，在NtCCD8、NtPDS和NtPDR6基因實現了77.8％、81.8％和87.5％的突變效率，雙等位突變效率分別為16.7％、36.4％和6.25％(Gao，et?al，2015,2018)。煙草多基因編輯方面，Jansing等(Jansing?et?al，2018)靶向4個本氏煙a-1,3-fucose基因獲得了10％-14％的編輯效率，靶向β-1,2-xylose時獲得了62-67％的編輯效率。謝小東等(2019)利用5個u6-26啟動子串聯同時敲除5個基因，單基因切割效率在76.9-92.3％，同時編輯的效率僅為53.8％，但純合/雙等位編輯效率未檢測。

傳統基因編輯載體，實現10-85％左右的單倍體基因編輯效率，但純合或雙等位編輯僅為6.3-36.4％。同時，由于基因功能的冗余性，對于多倍體植物來說，常常需要同時編輯一個同源基因及基因家族，才能獲得需要的發育表型，因此存在著多倍體植物編輯效率低的缺陷。

發明內容

本公開的目的是提高多倍體植物編輯效率。

本發明的發明人出乎意料地發現：在同一載體中，使用35Spro啟動子驅動gRNA，并且使用鈣網蛋白啟動子元件驅動spCas9蛋白，能夠大幅度地提高多倍體植物編輯效率，由此得到本發明。

因此，為了實現上述目的，本公開第一方面提供一種能夠在煙草中進行高效基因編輯的載體，所述載體中依次插入有35Spro啟動子、gRNA插入區、eu終止子、鈣網蛋白啟動子元件、spCas9蛋白表達元件、ubp終止子和潮霉素篩選標記，所述鈣網蛋白啟動子元件的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。

優選地，所述35Spro啟動子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.10；所述gRNA插入區的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.11；所述eu終止子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.12；所述spCas9蛋白表達元件的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.13；所述ubp終止子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.14；所述潮霉素篩選標記的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.15。