[發明專利]一種能夠在煙草中進行高效基因編輯的載體及其應用有效
| 申請號： | 202110786304.5 | 申請日： | 2021-07-12 |
| 公開（公告）號： | CN113667689B | 公開（公告）日： | 2023-04-11 |
| 發明（設計）人： | 代常波;呂婧;孫玉合;李冰潔;王李先秋 | 申請（專利權）人： | 中國農業科學院煙草研究所(中國煙草總公司青州煙草研究所) |
| 主分類號： | C12N15/82 | 分類號： | C12N15/82;C12N15/84;C12N15/55;C12N15/113 |
| 代理公司： | 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙) 11447 | 代理人： | 耿超 |
| 地址： | 266101 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 能夠 煙草 進行 高效 基因 編輯 載體 及其 應用 | ||
1.一種能夠在煙草中進行高效基因編輯的載體，其特征在于，所述載體中依次插入有35Spro啟動子、gRNA插入區、eu終止子、鈣網蛋白啟動子元件、spCas9蛋白表達元件、ubp終止子和潮霉素篩選標記，所述鈣網蛋白啟動子元件的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。
2.根據權利要求1所述的載體，其中，所述35Spro啟動子的核苷酸序列為SEQ?IDNO.10；所述gRNA插入區的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.11；所述eu終止子的核苷酸序列為SEQID?NO.12；所述spCas9蛋白表達元件的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.13；所述ubp終止子的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.14；所述潮霉素篩選標記的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.15。
3.根據權利要求1所述的載體，其中，所述gRNA插入區中插入有至少2段tRNA切割序列；所述tRNA切割序列的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.8；所述spCas9蛋白表達元件中具有NLS元件和PA50元件。
4.根據權利要求1所述的載體，其中，所述載體的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.9。
5.一種在煙草中進行高效基因編輯的方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：
（1）在權利要求1-4中任意一項所述的載體的gRNA插入區中插入靶向待編輯基因的gRNA編碼序列，得到基因編輯載體；
（2）用所述基因編輯載體轉化農桿菌，得到轉化體；
（3）將所述轉化體侵染預培養的煙草葉片，得到侵染后的煙草葉片；
（4）將所述侵染后的煙草葉片在含有潮霉素的培養基中進行培養。
6.根據權利要求5所述的方法，其中，所述靶向待編輯基因的gRNA的核苷酸序列為SEQID?NO.?4、5、6或7。
7.根據權利要求5所述的方法，其中，所述基因編輯載體的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.9的第9754位-第9769位被替換為SEQ?ID?NO.?2后得到的序列，或者為SEQ?ID?NO.9的第9754位-第9769位被替換為SEQ?ID?NO.?3后得到的序列。
8.鈣網蛋白啟動子元件，其中，所述鈣網蛋白啟動子元件的核苷酸序列為SEQ?IDNO.1。
9.鈣網蛋白啟動子元件在構建基因編輯載體中的用途，其中，所述鈣網蛋白啟動子元件的核苷酸序列為SEQ?ID?NO.1。
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