[發(fā)明專利]一種海洋鏈霉菌磷脂酶D突變體和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110785800.9
• 申請日: 2021-07-12
• 公開（公告）號: CN113604453B
• 公開（公告）日: 2023-06-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王永華;王方華;胡榮康;藍(lán)東明;楊博
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12N9/16
• 分類號: C12N9/16;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P13/06;C12R1/19
• 代理公司: 廣州市華學(xué)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發(fā)明公開了一種海洋鏈霉菌磷脂酶D突變體和應(yīng)用，所述的磷脂酶D突變體是在氨基酸序列為SEQ?ID?NO:1的基礎(chǔ)上單點(diǎn)突變380位點(diǎn)氨基酸所得。本發(fā)明磷脂酶D突變體酶活力顯著提高，實(shí)驗(yàn)測定突變體1(S380A)的酶活力是野生型的2.4倍，突變體2(S380F)的酶活力是野生型的1.1倍，突變體3(S380V)的酶活力是野生型的2.6倍，突變體4(S380M)的酶活力是野生型的1.2倍，突變體5(S380L)的酶活力是野生型的1.6倍。同時，本發(fā)明突變體的催化效率也顯著提高，酶活力和催化性能的改善進(jìn)一步提升了該酶的工業(yè)利用價值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶的基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及利用分子生物學(xué)定點(diǎn)突變技術(shù)獲得催化性能顯著提高的磷脂酶D突變體及其重組表達(dá)制備方法。

背景技術(shù)

磷脂是一種含有磷酸的混合脂類，是生物膜的基本成分和組成生命的必需物質(zhì)。此外，磷脂由于其獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和保健功能，已廣泛應(yīng)用于乳化劑、化妝品成分、醫(yī)藥配方和脂質(zhì)體制劑。在工業(yè)中，天然磷脂主要是毛油精煉脫水和脫膠的副產(chǎn)品。近年來，人們對不同分子性質(zhì)如電荷、極性、大小等的磷脂產(chǎn)生了極大的興趣，以獲得具有優(yōu)良加工性能和突出生理藥理功能的特殊功能磷脂。因此，對天然磷脂進(jìn)行改性已成為實(shí)現(xiàn)磷脂副產(chǎn)物高價值利用的重要途徑。

酶法修飾改性是制備功能性磷脂的一個重要方向。作為磷脂酶家族的重要成員，磷脂酶D(PLD)是合成和改造磷脂質(zhì)的一類重要工具酶。磷脂酶D(PLD)(EC?3.1.4.4)可通過磷脂酰基轉(zhuǎn)移作用(transphosphatidylation)催化磷脂質(zhì)極性頭部基團(tuán)發(fā)生轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而合成為各種不同的稀有磷脂及系列功能性磷脂衍生物。PLD已被用于合成較少豐富的磷脂，如磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)，磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)和磷脂酰肌醇(phatidylglycerol，PI)。除此之外，通過PLD還合成了大量新型磷脂，其中包括磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)中的膽堿被脂族醇、糖類，核苷、芳香醇或n-雜環(huán)醇所取代。因此，開發(fā)有工業(yè)應(yīng)用價值的PLD具有重要的意義和發(fā)展前景。

磷脂酶D來源單一、酶活力低下、制備難度大、成本高是當(dāng)前制約該類酶開發(fā)的技術(shù)瓶頸。PLD自身酶學(xué)性質(zhì)好壞是決定該酶是否可用于商品化酶制劑開發(fā)的關(guān)鍵因素，其中酶活力低下成為主要的制約因素，離工業(yè)化應(yīng)用的需求還有很大的差距。利用蛋白質(zhì)工程對酶分子進(jìn)行改造成為解決該問題的主要方案，如中國發(fā)明專利201610402557.7中利用重組DNA技術(shù)對野生型磷脂酶D基因進(jìn)行定點(diǎn)突變，得到活力較高的磷脂酶D基因。重組表達(dá)后，檢測高活力磷脂酶D的比酶活較野生型磷脂酶D提高38-140％。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明解決的技術(shù)問題是提供一種高活力磷脂酶D，及利用其制備磷脂酰絲氨酸的方法。

SEQ?ID?No.1

DSSATPHLDAVEQTLRQVSPGLEGRVWERTAGNALDAPAGDPAGWLLQTPGCWGDANCAERTGTKRLLARMTENISKATRTVDISTLAPFPNGAFQDAIVAGLKKSVENGNKPKVRVLVGAAPVYHMNVLPSKYRDDLRDKLGKAADGLTLNVASMTTSKTAFSWNHSKLLVVDGQSAITGGINSWKDDYVDTTHPVSDVDLALTGPAAGSAGRYLDQLWTWTCENKSNIASVWFAASPGAGCMPTMEKDANPVPAAATGNVPVIAVGGLGVGIKDSDPSSAFKPELPSAPDTKCVVGLHDNTNADRDYDTVNPEESALRALVGSARSHVEISQQDLNATCPPLPRYDVRLYDALAAKLAAGVKVRIVVSDPENRGAVGSGGYSQIKSLNEISDLLRNRLSLLPGGAQGAKTAMCGNLQLATARSSDSAKWADGKPYAQHHKLVSVDDSAFYIGSKNLYPSWLQDFGYIVESPEAARQLDAELLAPQWKYSQATATFDYARGICQG