[發明專利]一種用于檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請號: 202110780216.4
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113528683A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發明（設計）人: 范紅結;胡雨婷;李劍男;肖寧;周紅;藺輝星
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

1.一種用于檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對，其特征在于，所述引物對包括上游引物和下游引物，其核酸序列如下所示：

上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。

2.根據權利要求1所述的用于檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對，其特征在于，所述絕對熒光定量PCR引物對是根據豬源胞內勞森菌aspA基因序列，通過引物設計軟件設計，并進行驗證獲得。

3.一種用于檢測胞內勞森菌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含權利要求1所述的引物對。

4.一種檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR方法，其特征在于，包括利用權利要求1所述的引物對，進行熒光定量PCR檢測。

5.根據權利要求4所述的檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR方法，其特征在于，所述絕對熒光定量PCR方法包括以下步驟：

(1)提取胞內勞森菌感染豬回腸樣品中的基因組DNA；

(2)利用權利要求1所述的引物對，PCR擴增aspA基因；

(3)利用步驟(2)擴增所得目的基因片段，構建重組陽性質粒aspA-pMD18-T/DH5α；

(4)以構建的aspA-pMD19-T/DH5α重組質粒作為陽性標準品，進行qPCR反應，制備標準曲線；

(5)提取待測樣品基因組DNA，隨后以其為模板進行qPCR反應，反應體系同步驟(4)，將得到的CT值代入步驟(4)所得標準曲線，從而計算出待測樣品中胞內勞森菌的基因拷貝數。

6.根據權利要求5所述的檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟(2)中，利用權利要求1所述的引物對PCR擴增aspA基因，反應體系包括：2×Taq Mix、ddH₂O、權利要求1所述引物對、DNA模板；反應程序為：92-98℃預變性4-6min，92-98℃變性25-35s，50-60℃退火25-30s，68-74℃延伸0.5-1.5min，共28-32個循環，68-74℃延伸8-12min。

7.根據權利要求5所述的檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟(4)中，所述標準曲線的制備方法包括如下：

標準品的濃度可按下列公式折算為拷貝數：

提取陽性重組質粒aspA-pMD19-T/DH5α后測定濃度，換算成拷貝數，并10倍比連續稀釋5個稀釋倍數，作為標準陽性模板進行qPCR反應，反應結束后，以標準品的CT值為橫坐標，標準品的拷貝數的Log值為縱坐標，進行線性擬合，繪制標準曲線。

8.根據權利要求5所述的檢測胞內勞森菌的絕對熒光定量PCR方法，其特征在于，步驟(4)中，所述qPCR反應的反應體系包括：模板，權利要求1所述引物對，ROXReferenceDyeⅡ，2×SYBRGreenIMix，ddH₂O；程序包括：92-98℃預變性25-35s，92-98℃變性4-6s，55-65℃退火28-32s，反應程序共38-42個循環。