[發(fā)明專利]一種用于檢測胞內(nèi)勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110780216.4
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113528683A
• 公開（公告）日: 2021-10-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 范紅結(jié);胡雨婷;李劍男;肖寧;周紅;藺輝星
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/06;C12N15/11
• 代理公司: 南京中律知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

本發(fā)明公開了一種用于檢測胞內(nèi)勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對、試劑盒及檢測方法，所述引物對包括上游引物和下游引物，其核酸序列如下所示：上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。本發(fā)明還建立了一種胞內(nèi)勞森菌絕對熒光定量PCR檢測方法，該方法包括利用所述的引物對，進(jìn)行熒光定量PCR檢測。與傳統(tǒng)方法相比，基于核酸特異性序列分子方法的實(shí)時熒光定量PCR具有快速、敏感、特異且穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明可用于臨床樣品中低含量胞內(nèi)勞森菌的快速和特異檢測，可通過定量方法檢測胞內(nèi)勞森菌含量，從而為了解胞內(nèi)勞森菌在豬體內(nèi)的變化規(guī)律，以及為豬增生性回腸炎的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及胞內(nèi)勞森菌致病機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于胞內(nèi)勞森菌檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測胞內(nèi)勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對、試劑盒及檢測方法。

背景技術(shù)

豬回腸炎，又稱豬增生性回腸炎(porcine proliferative enteritis，PPE)，是由胞內(nèi)勞森菌(Lawsoniaintracellularis，L.intracellularis)感染引起的一種接觸性腸道傳染病，主要影響豬群生長速度，給養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，已成為現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中一種重要的腸道疾病。PPE在歐洲和美國等地發(fā)病率可達(dá)50％-70％，在韓國、泰國、馬來西亞等國家，PPE陽性率達(dá)100％，僅美國養(yǎng)豬業(yè)一年因PPE造成的損失就不低于2000萬美元，英國一年因PPE損失約400萬英鎊。在歐洲，由于抗生素和添加劑明令禁止使用，使得當(dāng)?shù)鼗啬c炎的危害性已大大超過了呼吸道疾病。從2005年來，PPE已成為中國華南、華東地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)豬場的一種常見病，檢測結(jié)果表明，3-4周齡和8-10周齡豬群PPE陽性率一般低于50％，而從18-24周齡PPE陽性率高達(dá)50％-70％，后備母豬和經(jīng)產(chǎn)母豬陽性率分別為60％-80％。由于抗生素的濫用，使得細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，這將對PPE的防控構(gòu)成嚴(yán)重威脅。

高效、簡便的檢測技術(shù)是有效防治養(yǎng)殖場傳染病的必要條件，一種能夠快速、準(zhǔn)確、定量的檢測樣品中胞內(nèi)勞森菌的檢測方法將對該病的診斷及防控帶來重大意義。對于PPE的診斷，國際普遍使用的診斷方法主要分為特異性診斷和非特異性診斷兩大類。其中，以組織病理學(xué)診斷為主的非特異性診斷方法有Warthin-Staixy銀染技術(shù)、蘇木素－伊紅染色(HE)、Ziehl-Neelsen法等；特異性的診斷方法包括血清學(xué)、分子生物學(xué)和組織學(xué)的診斷，包括間接免疫熒光光試驗(yàn)(IFA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫組化(IHC)、原位雜交(ISH)等技術(shù)。目前，中國國內(nèi)主要是通過常規(guī)PCR、多重PCR等分子生物學(xué)方法間接地檢測樣品中LI的核酸。常規(guī)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)通過目的基因的擴(kuò)增可使用少量的樣品得到準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，具有操作簡便、設(shè)備要求不高、反應(yīng)迅速且能進(jìn)行大批量檢測的優(yōu)點(diǎn)，成為了現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)中檢測胞內(nèi)勞森菌的常用方法，，但由于該方法靈敏性低，無法對臨床樣品中的細(xì)菌進(jìn)行定量等缺點(diǎn)，從而無法真實(shí)反應(yīng)豬群的感染情況，鑒于此，建立一種準(zhǔn)確、可靠、可定量的檢測臨床樣品中胞內(nèi)勞森菌的檢測方法對于PPE的有效防控具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：針對上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于檢測胞內(nèi)勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對、試劑盒及檢測方法，為PPE的診斷、流行病學(xué)調(diào)查及胞內(nèi)勞森菌的定量檢測等工作奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)方案：為了達(dá)到上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：

一種用于檢測胞內(nèi)勞森菌的絕對熒光定量PCR引物對，所述引物對包括上游引物和下游引物，其核苷酸序列如下所示：

上游引物：GCTGTGGATTGGGAGAAATC(SEQ ID NO.1)；

下游引物：CAAGTTGACCAGCCTCTGC(SEQ ID NO.2)。

所述絕對熒光定量PCR引物對是根據(jù)豬源胞內(nèi)勞森菌aspA基因序列，通過引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)，并進(jìn)行驗(yàn)證獲得。