[發(fā)明專利]一種Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及其應(yīng)用在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 202110779553.1 | 申請日： | 2021-07-09 |
| 公開（公告）號： | CN113584080A | 公開（公告）日： | 2021-11-02 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 方六榮;方譜縣;肖少波;張慧暢;夏思進;任杰;張健淞 | 申請（專利權(quán)）人： | 華中農(nóng)業(yè)大學(xué) |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/90;C12N15/50;C12N15/55;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/02;A61K31/4745;A61P31/14;C12R1/93 |
| 代理公司： | 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231 | 代理人： | 徐紹新 |
| 地址： | 430070 湖*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 nluc 標記 重組 冠狀病毒 感染性 克隆 質(zhì)粒 構(gòu)建 及其 應(yīng)用 | ||
1.一種Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于包括以下步驟：
(1)設(shè)計兩條靶向豬δ冠狀病毒NS6基因的sgRNA引物，分別通過與引物scaffold oligo進行重疊延伸PCR擴增，獲得豬δ冠狀病毒sgRNA-△NS6a、sgRNA-△NS6b的轉(zhuǎn)錄模板，經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄獲得sgRNA-△NS6a和sgRNA-△NS6b，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)體外切割含有豬δ冠狀病毒全長cDNA的BAC質(zhì)粒，經(jīng)試劑盒回收獲得線性化BAC載體；
(2)以含有豬δ冠狀病毒全長cDNA的BAC質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物分別擴增豬δ冠狀病毒NS6基因上游片段和下游片段；以Nluc表達質(zhì)粒為模板，設(shè)計引物擴增Nluc基因片段；將所述NS6基因上、下游片段和Nluc基因片段進行重疊延伸PCR擴增，獲得含有豬δ冠狀病毒NS6基因上、下游序列以及Nluc基因序列的融合片段，該融合片段與上述線性化BAC載體上、下游各含有20bp的同源臂；
(3)將步驟(1)的線性化BAC載體與步驟(2)的融合片段進行同源重組，獲得Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒；
(4)將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至化學(xué)感受態(tài)細胞中，利用PCR篩選陽性克隆，將測序正確的陽性克隆擴大培養(yǎng)后大量提取質(zhì)粒。
2.如權(quán)利要求1所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于：所述豬δ冠狀病毒為CHN-HN-2014株。
3.如權(quán)利要求1所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于，所述兩條靶向豬δ冠狀病毒NS6基因的sgRNA引物分別為：
sgPDCoV-△NS6a：SEQ ID NO:1；
sgPDCoV-△NS6b：SEQ ID NO:2。
4.如權(quán)利要求1所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(1)中所述的體外切割，其反應(yīng)體系為：2.5μg含有豬δ冠狀病毒全長cDNA的BAC質(zhì)粒，2μL Cas9 nuclease，1μ1sgRNA-△NS6a，1μl sgRNA-△NS6b，5μL 10×reactionbuffer，補加RNase水至總體積為50μL。
5.如權(quán)利要求1所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于，步驟(2)中，用于分別擴增豬δ冠狀病毒NS6基因上游序列和下游序列的引物分別為：
PDCoV-NS6-upF：SEQ ID NO:4；
PDCoV-NS6-upR：SEQ ID NO:5；
PDCoV-NS6-downF：SEQ ID NO:6；
PDCoV-NS6-downR：SEQ ID NO:7。
6.如權(quán)利要求1所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于：步驟(2)中，在進行重疊延伸PCR擴增時，所述NS6基因上、下游片段和Nluc基因片段的摩爾量比為2：2：1。
7.如權(quán)利要求1所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建方法，其特征在于：步驟(3)中，在進行同源重組時，所述線性化BAC載體與融合片段的摩爾量比為1:4。
8.Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞后獲得的重組病毒，其特征在于：所述Nluc標記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒是按權(quán)利要求1-8任一項所述方法構(gòu)建的。
9.權(quán)利要求8所述的重組病毒在篩選抗豬δ冠狀病毒藥物中的應(yīng)用。
10.鹽酸石蒜堿在制備抗豬δ冠狀病毒藥物中的用途。
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