[發(fā)明專利]一種Nluc標(biāo)記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110779553.1
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113584080A
• 公開（公告）日: 2021-11-02
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 方六榮;方譜縣;肖少波;張慧暢;夏思進;任杰;張健淞
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/90;C12N15/50;C12N15/55;C12N7/01;C12Q1/70;C12Q1/02;A61K31/4745;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 武漢智嘉聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

本發(fā)明公開了一種Nluc標(biāo)記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒構(gòu)建及其應(yīng)用，針對豬δ冠狀病毒，采用BAC系統(tǒng)和CRISPR/Cas9技術(shù)相結(jié)合的方式，基于已構(gòu)建成功的PDCoV感染性克隆質(zhì)粒，先通過CRISPR/Cas9切割PDCoV感染性克隆質(zhì)粒，再通過同源重組方式獲得Nluc基因替換NS6基因的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后拯救出穩(wěn)定表達(dá)Nluc的重組病毒，通過藥物實驗證實該重組病毒可為抗豬δ冠狀病毒藥物的篩選研究提供非常有價值的技術(shù)工具。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動物傳染病防治和分子生物學(xué)領(lǐng)域。具體涉及一種Nluc標(biāo)記的重組豬δ冠狀病毒感染性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

豬δ冠狀病毒(PDCoV)屬于套式病毒目冠狀病毒科δ冠狀病毒屬，是一種有囊膜、基因組為不分節(jié)段的單股正鏈RNA病毒。2012年，香港學(xué)者Woo等首次在病料中檢測到豬δ冠狀病毒(Woo P.C.Y,Discovery of seven novel Mammalian and avian coronaviruses inthe genus deltacoronavirus supports bat coronaviruses as the gene source ofalphacoronavirus and betacoronavirus and avian coronaviruses as the genesource of gammacoronavirus and deltacoronavirus.J.Virol.2012,86:3995-4008)。2014年，PDCoV在美國豬場爆發(fā)，研究人員從腹瀉豬的糞便和腸道中首次分離出豬δ冠狀病毒，并發(fā)現(xiàn)了PDCoV在美國多個州廣泛流行。隨后，韓國、泰國、老撾、越南、日本等多個國家報道了PDCoV的感染(Saeng-Chuto K et al,Different Lineage of PorcineDeltacoronavirus in Thailand,Vietnam and Lao PDR in 2015.Transbound EmergDis.2017,64(1):3-10；Suzuki T et al,Genetic characterization and pathogenicityof Japanese porcine deltacoronavirus.2018,61:176-182)。本課題組分析了2004～2014年間我國多個省份規(guī)模化豬場的糞便樣品，首次證實我國規(guī)模化豬場內(nèi)存在PDCoV，從河南省的仔豬腹瀉內(nèi)容物中分離獲得PDCoV CHN-HN-2014株，動物實驗證實PDCoV感染可引起仔豬嚴(yán)重腹瀉、嘔吐、脫水(Dong et al,Isolation,genomic characterization,andpathogenicity of a Chinese porcine deltacoronavirus strain CHN-HN-2014.VetMicrobiol.2016,196:98-106)。最近的研究發(fā)現(xiàn)犢牛和雞對PDCoV易感，體外細(xì)胞實驗證實PDCoV也可感染人源細(xì)胞，提示PDCoV存在跨種傳播的可能性(Jung et al,Calves aresusceptible to infection with the newly emerged porcine deltacoronavirus,butnot with the swine enteric alphacoronavirus,porcine epidemic diarrheavirus.2017,162:2357-2362；Li et al,Broad receptor engagement of an emergingglobal coronavirus may potentiate its diverse cross-speciestransmissibility.2018,115:E5135-E5143)。此外，PDCoV常與豬流行性腹瀉病毒(PEDV)、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)及其他病毒混合感染，給豬腸道病毒的防控帶來了更大的挑戰(zhàn)，嚴(yán)重影響了養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。