[發明專利]一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法

在審

• 申請號: 202110777344.3
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113624861A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 樊萌;安瑾;劉軒;胡尊芳
• 申請（專利權）人: 北京益微生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72;C07K1/14
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 葉似錦

1.一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，

A、所述提取的方法，包括：

A1、細胞外囊泡提取；

A2、用生物素標記法對所述細胞外囊泡膜蛋白進行標記；

A3、蛋白裂解后，去除游離生物素后，通過磁珠捕獲分離出所述生物素標記的所述細胞外囊泡膜蛋白；

A4、去除未被所述生物素標記的所述細胞外囊泡膜蛋白；

A5、通過二硫鍵切割將所述生物素與所述細胞外囊泡膜蛋白分離；

B、所述分析的方法，包括：

利用胰蛋白酶對提取后的所述細胞外囊泡膜蛋白進行接酶切，采用液相色譜串聯質譜進行分析。

2.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述A1步驟包括密度梯度離心、超速離心、尺寸排阻色譜法、超濾、聚乙二醇沉淀或試劑盒中的一種。

3.根據權利要求2所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述A1步驟為超速離心，包括：

收集細胞培養上清后，250～350g離心10min，收集上清；再2500～3500g離心10min，收集上清；再9500～11000g離心30min，收集上清；再100000g離心70min，去除上清后，加入1mlPBS洗滌溶解沉淀；再100000g離心70min，去除上清，加入500μLPBS溶解，獲得所述細胞外囊泡溶液。

4.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述提取后獲得的細胞外囊泡的平均粒徑為200-220nm。

5.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述A3步驟包括所述蛋白裂解的方法為使用蛋白裂解液后冰上孵育8-12min，得到細胞外囊泡蛋白裂解液；

優選地，所述蛋白裂解液為SDS裂解液、尿素或RIPA裂解液中的一種；

將所述蛋白裂解液加入尺寸排阻色譜柱，以去除所述游離生物素；

優選地，所述尺寸排阻色譜柱可以截留的分子大小為小于8-12KD。

6.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述A3中，所述磁珠為偶聯鏈霉親和素的磁珠，所述磁珠粒徑大小為1-4μm。

7.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述A4步驟包括利用磁鐵，以去除未被所述生物素標記的細胞外囊泡蛋白。

8.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述A4步驟包括加入DTT溶液。

9.根據權利要求1所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述B步驟的方法包括：

將所述酶切后的溶液進行45℃熱干，然后用0.1％甲酸水溶液定容；

所述質譜的上樣量為1μg。

10.根據權利要求1～9任一項所述的細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，其特征在于，所述細胞的來源包括血漿、血清、尿液、腦脊液、細胞培養液、組織液等的一種或多種。