[發明專利]一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法

在審

• 申請號: 202110777344.3
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113624861A
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 樊萌;安瑾;劉軒;胡尊芳
• 申請（專利權）人: 北京益微生物科技有限公司
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/14;G01N30/72;C07K1/14
• 代理公司: 北京盛凡智榮知識產權代理有限公司 11616
• 代理人: 葉似錦

本發明公開了一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法。該方法包括：使用磁珠特異性富集提取細胞外囊泡膜蛋白，并結合蛋白質譜技術，對膜蛋白的組成進行鑒定和分析。該方法可避免蛋白質譜分析過程中，高豐度的非細胞外囊泡膜蛋白信號的影響和干擾，有助于鑒定出更多種類的細胞外囊泡膜蛋白。

技術領域

本發明屬于生物技術及分析化學領域，具體涉及一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法。

背景技術

細胞外囊泡(ExtracellularVesicles，EVs；包括外泌體(exosome，大小40-150nm))是原核生物/真核生物細胞經過“內吞-融合-外排”等一系列調控過程而形成的細胞外納米級小囊泡(40-1000nm)，廣泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁、淋巴液、腹水等體液以及細胞培養上清中，且含量豐富，1ml血液可達108-1012個。細胞外囊泡包含有蛋白質/多肽、脂質、mRNAs、microRNAs和DNA等多種成分。其中，細胞外囊泡膜蛋白決定細胞外囊泡與靶細胞之間的相互作用，參與調控各種生理(發育等)和病理(腫瘤、心血管疾病、炎癥等)過程。

細胞外囊泡膜蛋白可以作為腫瘤等疾病的重要診斷標志物以及治療靶點，在腫瘤免疫反應以及免疫治療中也發揮著重要作用。例如，SaniaA等人通過蛋白質組學分析篩選鑒定了胰腺癌細胞外囊泡膜蛋白GPC1，可以實現早期胰腺癌的診斷。腫瘤細胞分泌的細胞外囊泡膜蛋白PD-L1，可以識別T細胞表面的PD-1，直接抑制抗腫瘤免疫反應，并且其表達水平，與患者對藥物的敏感性相關，可用于PD-1藥物的療效預測。此外，細胞外囊泡膜蛋白可以應用于細胞外囊泡亞群的分離和檢測，特別是干細胞來源細胞外囊泡亞群的分離純化，從而應用于疾病的治療。因此，針對細胞外囊泡的膜蛋白分析在疾病的診斷以及治療中具有重要的應用價值。

目前，細胞外囊泡膜蛋白的分析方法，一般通過流式或者ELISA的方法，存在檢測通量小的缺點。或利用質譜技術進行鑒定分析。由于細胞外囊泡膜蛋白的豐度相對較低，進行蛋白質譜分析時，細胞外囊泡膜蛋白的信號容易受到細胞外囊泡內高豐度蛋白的干擾和掩蓋，導致無法鑒定出。因此，有必要開發一種特異性提取富集細胞外膜蛋白的方法，以克服現有技術中待解決的問題，從而將極大地促進細胞外囊泡膜蛋白的研究進展，推動細胞外囊泡在疾病診斷和治療方面的臨床應用。

有鑒于此，特提出本發明。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術中存在的不足，提供一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法。本發明使用磁珠特異性富集提取細胞外囊泡膜蛋白，并結合蛋白質譜技術，對膜蛋白的組成進行鑒定和分析。

為實現上述目的，本發明提出了一種細胞外囊泡膜蛋白提取與分析方法，包括：

A、所述提取的方法，包括：

A1、細胞外囊泡提取；

A2、用生物素標記法對所述細胞外囊泡膜蛋白進行標記；

A3、蛋白裂解后，去除游離生物素后，通過磁珠捕獲分離出所述生物素標記的所述細胞外囊泡膜蛋白；

A4、去除未被所述生物素標記的所述細胞外囊泡膜蛋白；

A5、通過二硫鍵切割將所述生物素與所述細胞外囊泡膜蛋白分離；

B、所述分析的方法，包括：

利用胰蛋白酶對提取后的所述細胞外囊泡膜蛋白進行接酶切，采用液相色譜串聯質譜進行分析。

進一步的，所述A1步驟包括密度梯度離心、超速離心、尺寸排阻色譜法、超濾、聚乙二醇沉淀或試劑盒中的一種。