[發(fā)明專(zhuān)利]一種咪康唑手性中間體的生物合成方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110777213.5
• 申請(qǐng)日: 2021-07-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113667702A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-11-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王普;張瑩;桂鉛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P7/22
• 分類(lèi)號(hào): C12P7/22;C12N1/16;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟

本發(fā)明提供一種咪康唑手性中間體的生物合成方法，所述的方法為：以土星輪頭酵母(Cyberlindnera saturnus)ZJPH1807經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體為酶源，以2?氯?1?(2,4?二氯苯基)乙酮為底物，于pH 6.0～8.0的PBS緩沖液中構(gòu)成轉(zhuǎn)化體系，在20～45℃、200rpm條件下轉(zhuǎn)化2～24h，反應(yīng)結(jié)束后將轉(zhuǎn)化反應(yīng)液用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，取有機(jī)相，即得含有所述咪康唑手性中間體的乙酸乙酯溶液，本發(fā)明利用土星輪頭酵母ZJPH1807菌株靜息細(xì)胞為催化劑，生物不對(duì)稱還原2?氯?1?(2,4?二氯苯基)乙酮獲得相應(yīng)的(R)?2?氯?1?(2,4?二氯苯基)乙醇。利用該菌株制備所得產(chǎn)物的光學(xué)純度高，ee值99.9％。

(一)技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是一種咪康唑手性中間體的生物合成方法，屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域。

(二)背景技術(shù)

(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇(分子量：225.5，CAS號(hào)：114446-57-0)是制備咪康唑的關(guān)鍵手性中間體，其結(jié)構(gòu)式如下：

咪康唑是一種安全、高效、廣譜抗真菌藥，對(duì)致病性真菌幾乎都有作用。其機(jī)理是抑制真菌細(xì)胞膜的固醇合成，影響細(xì)胞膜通透性，抑制真菌生長(zhǎng)，導(dǎo)致死亡。在4μg/mL以下的濃度可抑制大部分臨床分離的真菌，其中新型隱球菌，念珠菌和粗孢子菌對(duì)其均敏感，皮炎芽生菌和組織胞漿菌對(duì)該藥物高度敏感，但曲霉菌較差。另外，咪康唑?qū)瘘S色葡萄球菌和鏈球菌以及革蘭氏陽(yáng)性球菌和炭疽菌等也有抗菌作用。

目前已有報(bào)道利用包括手性惡唑波烷催化劑、手性金屬催化劑和生物催化劑等不同種類(lèi)催化劑，通過(guò)催化不對(duì)稱加氫制備(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇。手性惡唑波烷催化劑的底物譜較廣，含銠、釕、銥等過(guò)渡金屬的催化劑是酮底物加氫反應(yīng)中最常用的催化劑。然而，過(guò)渡金屬需要額外的螯合官能團(tuán)提高對(duì)映體的選擇性，操作難控制，此外，過(guò)渡金屬的高成本也限制了其工業(yè)化應(yīng)用。與化學(xué)催化劑相比，生物催化劑的優(yōu)勢(shì)在于其反應(yīng)選擇性高和環(huán)境友好。隨著新型抗真菌藥物市場(chǎng)的增加，對(duì)(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇的需求量也迅速增加，因而開(kāi)發(fā)優(yōu)良的生物催化劑，建立生物催化制備(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇新工藝具有很好的應(yīng)用前景。

唐云平等(CN 108396040A)選取Candida macedoniensis AKU4588來(lái)源的羰基還原酶，底物2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮濃度為1～5g/L，羰基還原酶加量為20～100U/L，在緩沖液體系中催化2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮還原合成(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，ee值99％。Mangas等(The Journal of Organic Chemistry,2011,76(7):2115-2122.)使用醇脫氫酶在非常溫和的反應(yīng)條件下催化合成(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?3.86mmol/L時(shí)的產(chǎn)率和ee值都大于99％。最后又進(jìn)行了化學(xué)修飾，以便全面合成所需的單一形式的R對(duì)映體藥物。這種新穎的化學(xué)酶路線提供了明顯的優(yōu)勢(shì)，而不需要使用有害或有毒的催化劑來(lái)引入手性。Thiago等(Org.Chem.,2018,(18):2110-2116.)利用脂肪酶Novozym 435催化2,2',4'-三氯苯乙酮生物還原為(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，收率為46.5％，ee值99％。郁慧蕾等在專(zhuān)利(CN 106701698 A)中公開(kāi)了利用木糖發(fā)酵酵母菌CBS6054表達(dá)的羰基還原酶SsCR，以及羰基還原酶SsCR的突變體催化潛手性羰基化合物不對(duì)稱還原制備(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，實(shí)現(xiàn)99％以上的轉(zhuǎn)化率，產(chǎn)物光學(xué)純度為99.9％。

利用微生物全細(xì)胞作為催化劑，通過(guò)生物還原制備(R)-2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙醇，微生物酶源細(xì)胞可經(jīng)發(fā)酵自行制備，質(zhì)量穩(wěn)定，成本低廉。而且，在生物還原過(guò)程中，通過(guò)添加廉價(jià)的輔助底物可實(shí)現(xiàn)輔酶的原位再生。

(三)發(fā)明內(nèi)容