[發明專利]一種咪康唑手性中間體的生物合成方法

在審

• 申請號: 202110777213.5
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113667702A
• 公開（公告）日: 2021-11-19
• 發明（設計）人: 王普;張瑩;桂鉛
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12P7/22
• 分類號: C12P7/22;C12N1/16;C12R1/645
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟

1.一種咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于所述的方法為：以土星輪頭酵母ZJPH1807經發酵培養獲得的濕菌體為酶源細胞，以2-氯-1-(2,4-二氯苯基)乙酮為底物，于pH 6.0～8.0的PBS緩沖液中構成轉化體系，在20～45℃、200rpm條件下轉化2～24h，反應結束后，即得含有所述咪康唑手性中間體的轉化液；所述濕菌體的用量以PBS緩沖液的體積計為50～200g/L，所述底物的用量以PBS緩沖液的體積計為5～10g/L；

所述土星輪頭酵母ZJPH1807保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏編號CCTCC NO：M2019215，保藏日期2019年3月29日，保藏地址：中國，武漢，武漢大學，郵編430072。

2.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述PBS緩沖液的pH為7.2。

3.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述的轉化的條件為30℃，5～24h。

4.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述濕菌體的用量以PBS緩沖液的體積計為80g/L。

5.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述底物的用量以PBS緩沖液的體積計為5g/L。

6.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述PBS緩沖液的濃度為0.1M。

7.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述轉化體系中還添加有輔助底物，所述輔助底物為下列之一：葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、海藻糖、乙醇、甘油、異丙醇、1,2-丙二醇；所述輔助底物的加入量以所述PBS緩沖液的體積計為50～200g/L。

8.如權利要求7所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述輔助底物為葡萄糖、海藻糖或麥芽糖。

9.如權利要求8所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于：所述輔助底物為麥芽糖，所述輔助底物的加入量以所述PBS緩沖液的體積計為150g/L。

10.如權利要求1所述的咪康唑手性中間體的生物合成方法，其特征在于所述酶源細胞按如下方法制備：(1)斜面培養：將土星輪頭酵母ZJPH1807接種至斜面培養基，30℃培養24h，獲得斜面菌種；所述斜面培養基中各組分的終濃度組成為：葡萄糖15g/L，蛋白胨7.5g/L，酵母膏6g/L，(NH₄)₂SO₄ 3g/L，KH₂PO₄1.5g/L，NaCl 0.75g/L，MgSO₄·7H₂O 0.75g/L，瓊脂粉15～20g/L，溶劑為水，pH 6.5；

(2)種子培養：將步驟(1)所述的斜面菌種挑取一環菌體接種至種子培養基中，25～30℃、150～250rpm培養10～24h，獲得種子液；所述種子培養基中各組分的終濃度組成為：葡萄糖15g/L，蛋白胨20g/L，酵母膏10g/L，(NH₄)₂SO₄ 2g/L，KH₂PO₄ 2g/L，NaCll g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，溶劑為水，pH 6.5；

(3)發酵培養：將步驟(2)所述的種子液以體積濃度8％的接種量接種至發酵培養基中，30℃、200rpm發酵培養32h，發酵結束后，將所得發酵液離心，所得沉淀用0.1M、pH7.5磷酸緩沖液洗滌，離心收集濕菌體，即為酶源細胞；所述發酵培養基中各組分的終濃度組成為：葡萄糖34.36g/L，酵母膏14.89g/L，NH₄Cl 30.34g/L，KH₂PO₄ 1.01g/L，CaCl₂ 0.11g/L，溶劑為水，pH 7.5。