[發明專利]一種基于LAMP和自身猝滅熒光探針檢測鰹魚的引物組、方法和試劑盒

在審

• 申請號: 202110776557.4
• 申請日: 2021-07-09
• 公開（公告）號: CN113355435A
• 公開（公告）日: 2021-09-07
• 發明（設計）人: 熊雄;許文杰;崔曉文;操敏;熊曉輝
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 江蘇圣典律師事務所 32237
• 代理人: 仲凌霞;肖明芳

本發明公開了一種基于LAMP和自身猝滅熒光探針檢測鰹魚的引物組、方法和試劑盒，所述引物組包括一對外引物組，一對內引物組和一對環引物組；所述外引物組為F3和B3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述內引物組為FIP和BIP，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述環引物組為LF和LB，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。本發明所提供的方法，其靈敏度可達5fg/μL。

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測技術領域，本發明涉及一種基于LAMP和自身猝滅熒光探針檢測鰹魚的引物組、方法和試劑盒。

背景技術

鰹魚(Katsuwonus pelamis)，屬于硬骨魚綱(Osteichthyes)、鱸形目(Pereiformes)、鯖科(Scombridae)，是一種重要的經濟性海洋魚類，是世界金槍魚漁業捕撈對象之一。2018年，鰹魚捕撈量為316萬噸，占金槍魚捕撈總量的56％以上。在我國，金槍魚的消費量逐年遞增，市售金槍魚種類繁多，其市場價格也差異懸殊。然而，大多數金槍魚被加工成冰鮮切片、罐頭、魚干等產品進行銷售，而且產品包裝缺乏正確的學名標注。消費者難以從外觀上辨別出金槍魚的真假和所屬品種，由此造成了金槍魚市場命名混亂，以次充好的復雜現狀。2016年，安麗艷等在17個市售金槍魚罐頭中，發現58.8％來源于價格低廉的鰹魚。因此，急需建立一些快速準確、簡便實用的檢測方法應用于市售鰹魚成分的檢測。

目前，魚類的物種鑒定研究已逐漸從形態學轉向分子生物學技術。以DNA為基礎的分子檢測技術由于具有較高的靈敏度和特異性，已廣泛用于魚類物種鑒定。近年來，核酸等溫擴增技術在物種鑒定中發揮著重要作用。與PCR技術相比，等溫核酸擴增反應是一種無需反復升降溫，在同一溫度下即可完成對靶標指數擴增的技術，其中，環介導等溫擴增技術(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是Notomi于2000年開發的一種等溫核酸擴增方法。該技術依賴于自動循環的鏈置換反應，通過設計4種特異性引物識別靶標DNA的6個區域，從而實現靶標DNA的擴增。Nagamine等于2002年又通過增加了2條環引物(LoopF，Loop B)對LAMP進一步改進，提高了LAMP的擴增效率。相較于其他等溫擴增技術，LAMP是目前研究最多、最成熟的一種等溫擴增技術，其具有快速檢測、操作簡單、高靈敏度、高特異性等優點，更適合現場實地檢測。

通常，LAMP檢測為終點檢測，它需要對擴增后的產物進行測定，所以可能導致交叉污染或非特異性擴增。常見檢測方法包括：瓊脂糖凝膠電泳法，熒光目測比色法，實時濁度儀檢測法。但這些方法都有一定的局限性，瓊脂糖凝膠電泳中呈典型的梯狀條帶，只能判斷是否發生擴增，但不能通過片段的大小來判斷是否為非特異擴增，而且反應后開蓋易造成氣溶膠的污染；在擴增產物中加入熒光染料SYBR Green I，產物結合染料后發出綠色熒光，染料雖具有便捷、成本低、等優點，但在核酸拷貝數較低的情況下，指示劑從顏色中無法明顯區分陽性和陰性樣品，結果的判讀標準受觀察員主觀判斷影響較大；利用濁度儀檢測LAMP反應中焦磷酸鎂的沉淀，需大型儀器，成本昂貴，不適合現場檢測。

非特異性檢測方法的一個主要缺點是容易產生假陽性。盡管LAMP由4-6個不同的引物獨立識別靶序列上的6-8個獨立區域，在理論上比PCR具有更高的特異性。但是LAMP反應中使用的引物總濃度為3.6-4.4μM，，而在PCR反應中僅為0.4-1.0μM。其中LAMP的FIP和BIP引物長度為40-50bp，它們更容易形成引物二聚體或發夾結構，導致熒光染料與LAMP引物結合產生非特異性擴增。

基于堿基互補配對原則來識別特定核酸序列是特異性檢測的一種有效方法，專利CN201510154708.7提供了一種基于LAMP和分子信標檢測HPV16的方法，分子信標的設計需要在核酸兩端分別標記熒光基團和淬滅基團，而分子信標的合成費用較高。使得檢測成本增加。因此，本發明提供了一種基于LAMP和自身猝滅熒光探針檢測鰹魚的引物組、方法和試劑盒。

發明內容