[發(fā)明專利]一種蠟梅原生質(zhì)體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110773434.5
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN113403254B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙凱歌;李雅迪;楊楠;趙榮;張倩;向林;陳龍清
• 申請（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

本發(fā)明公開了一種蠟梅原生質(zhì)體的制備方法，該方法包含：在黑暗條件下培養(yǎng)蠟梅的花藥，誘導產(chǎn)生愈傷組織；將愈傷組織置于酶解溶液中，在振蕩培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，得到含原生質(zhì)體的酶解液；其中，酶解溶液包含：纖維素酶和離析酶；在酶解液中加入適量W5溶液稀釋，用細胞過濾器過濾；其中，W5溶液為氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、2?(N?嗎啉基)乙磺酸和水的混合液；將所得濾液離心，棄上清液，以獲得含蠟梅原生質(zhì)體的溶液。本發(fā)明的方法以蠟梅愈傷組織為材料制備原生質(zhì)體，使用纖維素酶和離析酶酶解液組合，不受取材時間、數(shù)量的影響，酶解可得到平均1.11×10⁶個/g的蠟梅原生質(zhì)體產(chǎn)量，高效快速。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種原生質(zhì)體的制備方法，具體涉及一種蠟梅原生質(zhì)體的制備方法。

背景技術(shù)

蠟梅(Chimonanthus praecox)是蠟梅科蠟梅屬的名貴花木，是珍貴的冬季觀花樹種。近年來，人們對蠟梅的需求與日俱增，蠟梅的應(yīng)用和市場不斷擴大，蠟梅的性狀遺傳和改良成為科研和產(chǎn)業(yè)的重點，蠟梅作為木本植物，遺傳轉(zhuǎn)化體系難以建立，建立蠟梅的遺傳轉(zhuǎn)化體系對蠟梅花色、花香、抗逆等基因功能有重大意義，而原生質(zhì)體提取正好是瞬時表達和遺傳性狀改良的一項基本技術(shù)。

植物的原生質(zhì)體指的是植物細胞除去細胞壁后，裸露出的細胞膜包裹的原生質(zhì)團部分。原生質(zhì)體因為沒有細胞壁隔絕外界環(huán)境，容易吸收導入的外源基因、染色體等遺傳物質(zhì)，能夠克服有性生殖的障礙，制備時間短，能夠快速觀測表型，實現(xiàn)基因的表達，成為了分子生物相關(guān)實驗中的理想受體。

蠟梅作為木本植物，生長周期長，植物結(jié)構(gòu)復雜，目前還沒有蠟梅原生質(zhì)體制備的相關(guān)研究，仍然處于起步階段。研究蠟梅原生質(zhì)體提取技術(shù)，獲取蠟梅原生質(zhì)體提取的最佳材料、制備方法，對蠟梅瞬時轉(zhuǎn)化體系的建立、遺傳轉(zhuǎn)化、體細胞雜交等有重大意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種蠟梅原生質(zhì)體的制備方法，以纖維素酶和離析酶的酶解液組合，以蠟梅愈傷組織為材料制備原生質(zhì)體，不受取材時間、數(shù)量的影響，酶解可得到平均1.11×10⁶個/g的蠟梅原生質(zhì)體產(chǎn)量，高效快速。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了一種蠟梅原生質(zhì)體的制備方法，該方法包含：在黑暗條件下培養(yǎng)蠟梅花藥，誘導愈傷組織；將所述愈傷組織置于酶解溶液中，在振蕩培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，得到含原生質(zhì)體的酶解液；其中，所述酶解溶液包含：纖維素酶和離析酶，纖維素酶的濃度為1.0～2.0％，離析酶的濃度為0.1～0.5％；在酶解液中加入適量W5溶液稀釋，用細胞過濾器過濾；其中，所述W5溶液為氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、2-(N-嗎啉基)乙磺酸和水的混合液；將所得濾液離心，棄上清液，以獲得含蠟梅原生質(zhì)體的溶液。

優(yōu)選地，誘導所述蠟梅花藥的培養(yǎng)基為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0～2.0mg/L 2,4-D。

優(yōu)選地，所述花藥愈傷組織在黑暗條件下培養(yǎng)，溫度為24±2℃，空氣濕度為44％。

優(yōu)選地，所述蠟梅花藥為選取紅心、素心或皺瓣基因型的蠟梅的花苞，經(jīng)清洗和消毒后，取下花藥；其中，所述清洗和消毒為，采用洗衣粉水浸泡，水洗，70％酒精浸泡，無菌水洗，0.1％氯化汞浸泡，無菌水洗。

優(yōu)選地，所述纖維素酶的濃度為1.0％，離析酶的濃度為0.1％。

優(yōu)選地，所述酶解溶液還包含：甘露醇、氯化鉀、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、氯化鈣和牛血清蛋白；其中，所述甘露醇的濃度為0.4mol/L，所述氯化鉀的濃度為0.02mol/L，所述2-(N-嗎啉基)乙磺酸的濃度為0.02mol/L，所述氯化鈣的濃度為0.02mol/L，所述牛血清蛋白的濃度為1.0％。

優(yōu)選地，所述愈傷組織于酶解溶液，在振蕩培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，溫度為22℃，轉(zhuǎn)速為70rpm/min。

優(yōu)選地，所述愈傷組織的振蕩培養(yǎng)時間為4～6h。