[發明專利]一種蠟梅原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 202110773434.5
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN113403254B
• 公開（公告）日: 2022-10-11
• 發明（設計）人: 趙凱歌;李雅迪;楊楠;趙榮;張倩;向林;陳龍清
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 龔燮英

1.一種蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，該方法包含：

在黑暗條件下培養蠟梅花藥，誘導愈傷組織；

將所述愈傷組織置于酶解溶液中，在振蕩培養箱中黑暗培養，得到含原生質體的酶解液；其中，所述酶解溶液包含：纖維素酶和離析酶，纖維素酶的濃度為1.0～2.0％，離析酶的濃度為0.1～0.3％；

在酶解液中加入適量W5溶液稀釋，用細胞過濾器過濾；其中，所述W5溶液為氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、2-(N-嗎啉基)乙磺酸和水的混合液；

將所得濾液離心，棄上清液，以獲得含蠟梅原生質體的溶液。

2.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，誘導所述蠟梅花藥的培養基為MS+1.0mg/L 6-BA+1.0～2.0mg/L 2,4-D。

3.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述花藥愈傷組織在黑暗條件下培養，溫度為24±2℃，空氣濕度為44％。

4.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述蠟梅花藥為選取紅心、素心或皺瓣基因型的蠟梅的花苞，經清洗和消毒后，取下花藥；其中，所述清洗和消毒為，采用洗衣粉水浸泡，水洗，70％酒精浸泡，無菌水洗，0.1％氯化汞浸泡，無菌水洗。

5.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述纖維素酶的濃度為1.0％，離析酶的濃度為0.1％。

6.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述酶解溶液還包含：甘露醇、氯化鉀、2-(N-嗎啉基)乙磺酸、氯化鈣和牛血清蛋白；其中，所述甘露醇的濃度為0.4mol/L，所述氯化鉀的濃度為0.02mol/L，所述2-(N-嗎啉基)乙磺酸的濃度為0.02mol/L，所述氯化鈣的濃度為0.02mol/L，所述牛血清蛋白的濃度為1.0％。

7.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述愈傷組織于酶解溶液，在振蕩培養箱中黑暗培養，溫度為22℃，轉速為70rpm/min。

8.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述愈傷組織的振蕩培養時間為4～6h。

9.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述細胞過濾器為75μm細胞過濾器。

10.根據權利要求1所述的蠟梅原生質體的制備方法，其特征在于，所述濾液的離心為為：200×g離心2min。