[發明專利]一種獲得大腸桿菌超級感受態細胞的制備方法

在審

• 申請號: 202110773406.3
• 申請日: 2021-07-08
• 公開（公告）號: CN113481229A
• 公開（公告）日: 2021-10-08
• 發明（設計）人: 曲紅金;呂妍;萬兵兵;曹禺;汪子喻;覃佐菊;李俊實
• 申請（專利權）人: 上海佐潤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/20;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 上海和華啟核知識產權代理有限公司 31339
• 代理人: 達曉玲

本發明公開了一種獲得大腸桿菌超級感受態細胞的制備方法，包括步驟為：接種受體菌，在LB固體培養基上劃線，獲取單克隆；將單克隆至培養基中，搖床上振蕩培養；當振蕩培養渾濁后，測定溶液的OD₆₀₀值；對溶液冷卻、離心，收集第一沉淀；采用緩沖液將所述第一沉淀重懸得到重懸液，并冷卻；再對重懸液離心，收集第二沉淀；采用緩沖液將所述第二沉淀重懸；滴加二甲基亞砜，冷卻，得到感受態細胞；將所述感受態細胞冷凍保存。本發明使用pUC19質粒DNA檢測，轉化效率可達5*10^9cfu/μg DNA。保存半年轉化效率都不會發生改變，質量穩定，使用方便，可以極大程度降低科研人員的實驗成本，提高研究效率。

技術領域

本發明涉及生命科學和基礎醫學科研領域，特別是涉及一種獲得大腸桿菌超級感受態細胞的制備方法。

背景技術

在自然條件下，很多質粒都可通過細菌結合作用轉移到新的宿主內，但在人工構建的質粒載體中，一般缺乏此種轉移所必需的mob基因，因此不能自行完成從一個細胞到另一個細胞的接合轉移。如需將質粒載體轉移進受體細菌，需誘導受體細菌產生一種短暫的感受態以攝取外源DNA。

轉化(Transformation)是將外源DNA分子引入受體細胞，使之獲得新的遺傳性狀的一種手段，它是微生物遺傳、分子遺傳、基因工程等研究領域的基本實驗技術。轉化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統缺陷的變異株，即不含限制性內切酶和甲基化酶的突變體(Rˉ，Mˉ)，它可以容忍外源DNA分子進入體內并穩定地遺傳給后代。受體細胞經過一些特殊方法(如電擊法，CaCl₂， RbCl(KCl)等化學試劑法)的處理后，細胞膜的通透性發生了暫時性的改變，成為能允許外源DNA分子進入的感受態細胞(Compenent cells)。

進入受體細胞的DNA分子通過復制，表達實現遺傳信息的轉移，使受體細胞出現新的遺傳性狀。將經過轉化后的細胞在篩選培養基中培養，即可篩選出轉化子(Transformant，即帶有異源DNA分子的受體細胞)。

目前常用的感受態細胞制備方法有CaCl₂和RbCl(KCl)法，雖然RbCl(KCl) 法制備的感受態細胞轉化效率較高，但CaCl₂法簡便易行，且其轉化效率已可以滿足一般實驗的要求，制備出的感受態細胞暫時不用時，可加入占總體積15％的無菌甘油于-80℃下保存，能保存半年，因此CaCl₂法使用更廣泛。

但是在CaCl₂制備方法中，感受態細胞產品的轉化效率還存在著巨大的進步空間，距離國際水平存在明顯差距，尤其從轉化效率上看，使用pUC19質粒DNA 檢測，目前我國市場上的感受態細胞產品轉化效率多數不足10^8cfu/μg DNA，仍需要不斷進步。

發明內容

本發明主要解決的技術問題是提供一種獲得大腸桿菌超級感受態細胞的制備方法，其優點是能快速制備，轉化效率更高，更加穩定，廣泛適用于基礎科研領域，提高科研人員實驗效率。

為解決上述技術問題，本發明采用的一個技術方案是：提供一種獲得大腸桿菌超級感受態細胞的制備方法，包括步驟為：

步驟1：接種受體菌，在LB固體培養基上劃線，獲取單克隆；

步驟2：將單克隆至培養基中，搖床上振蕩培養；

步驟3：當振蕩培養渾濁后，測定溶液的OD₆₀₀值；

步驟4：對溶液冷卻、離心，收集第一沉淀；

步驟5：采用緩沖液將所述第一沉淀重懸得到重懸液，并冷卻；

步驟6：再對重懸液離心，收集第二沉淀；

步驟7：采用緩沖液將所述第二沉淀重懸；

步驟8：滴加二甲基亞砜，冷卻，得到感受態細胞；