[發(fā)明專利]檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其魯棒性檢測方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110765594.5
• 申請(qǐng)日: 2021-07-07
• 公開（公告）號(hào): CN113355440B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉芝榮;張英華;王玉堂;徐欣;楊思佳
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黑龍江省綠色食品科學(xué)研究院
• 主分類號(hào): C12Q1/689
• 分類號(hào): C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所有限公司 37201
• 代理人: 邱岳

檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其魯棒性檢測方法，包括針對(duì)阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌三種致病菌各選擇了四種特異性基因，并針對(duì)所選基因設(shè)計(jì)了四套引物。檢測方法包括DNA模板的制備、建立四套多重PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序、PCR產(chǎn)物鑒定及結(jié)果觀察。本發(fā)明設(shè)計(jì)了四套引物、四套PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序來提高檢測方法的準(zhǔn)確性，避免了假陰性；同時(shí)，在保證靈敏度不變的情況下對(duì)退火溫度進(jìn)行范圍確定，避免了由于PCR儀溫度控制精度降低以及老化問題而影響目標(biāo)DNA的擴(kuò)增及檢測產(chǎn)生的不穩(wěn)定、不準(zhǔn)確的問題。同源性對(duì)比均超過99.06%；具有高度特異性；靈敏度可達(dá)到10 CFU/mL；與國標(biāo)方法比較具有更高的時(shí)效性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其魯棒性檢測方法。

背景技術(shù)

巴氏奶是乳制品中的一種，由于巴氏奶殺菌條件溫和，能夠最大限度地保留原料奶中的營養(yǎng)物質(zhì)和風(fēng) 味，深受消費(fèi)者歡迎。據(jù)調(diào)查，全球80％的國家以消費(fèi)巴氏奶為主，其中奶業(yè)發(fā)達(dá)國家如美國、日本、新 西蘭等國巴氏奶的消費(fèi)量占液態(tài)奶消費(fèi)量的80％以上。但是溫和的殺菌方式及產(chǎn)品生產(chǎn)過程中的衛(wèi)生污染 會(huì)導(dǎo)致一些致病菌仍可能殘留在最終的產(chǎn)品中。阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌是影響乳制品安全常見 的致病菌。據(jù)統(tǒng)計(jì)，50-80％的阪崎腸桿菌感染發(fā)生在乳制品中。大腸桿菌是自然界中存在最廣的細(xì)菌， 被認(rèn)為是乳品污染的重要指標(biāo)，感染劑量為10CFU/g。沙門氏菌感染嚴(yán)重，全世界報(bào)告的80％人類食源 性疾病感染都是由沙門氏菌引起的。我國巴氏奶中致病菌的檢測方法參照GB 19645-2010，整個(gè)過程包括 前增菌、選擇性增菌、平板分離、血清型實(shí)驗(yàn)、生化實(shí)驗(yàn)，該方法檢測時(shí)長需要5-7天，而巴氏奶的保質(zhì) 期一般只有3-7天。

多重PCR技術(shù)具有分析時(shí)間短、靈敏度低、特異性和自動(dòng)化潛力高等優(yōu)點(diǎn)，且一次反應(yīng)便可同時(shí)檢 測多種致病菌。多重PCR技術(shù)以其本身的優(yōu)勢(shì)使得該技術(shù)在多種領(lǐng)域中都有所研究，如食品中乳制品、水 果等檢測；疾病中牛乳房炎、呼吸道疾病的檢測；農(nóng)業(yè)中蚜蟲、轉(zhuǎn)基因成分的檢測。但是目前方法就多重 PCR的實(shí)際應(yīng)用上還存在一些局限性：以往研究中，對(duì)于一種致病菌，僅選擇一種該致病菌的特異性基因 設(shè)計(jì)引物，但是卻忽略了被檢測的致病菌如果出現(xiàn)基因缺失或者基因變異，會(huì)導(dǎo)致所建立的檢測方法無法 對(duì)該致病菌進(jìn)行有效識(shí)別檢測，造成假陰性結(jié)果的出現(xiàn)。

另一方面，多重PCR方法對(duì)退火溫度要求高，以往的方法在對(duì)退火溫度選擇時(shí)，僅僅根據(jù)電泳圖譜 選擇一個(gè)最優(yōu)的退火溫度值，但是卻忽略了PCR儀溫控不準(zhǔn)確或者其老化問題，導(dǎo)致控溫精度下降，使得 設(shè)置的退火溫度和實(shí)際儀器溫度有出入，影響了該檢測方法的準(zhǔn)確性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物，對(duì)于被檢測的三 種菌各選擇了四種特異性基因并設(shè)計(jì)了四套引物來提高檢測方法的準(zhǔn)確性，從而避免假陰性結(jié)果。同時(shí)， 發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種基于上述多重PCR引物的巴氏奶致病菌的魯棒性檢測方法，本方法對(duì)多重 PCR的退火溫度進(jìn)行范圍確定，在保證該方法靈敏度不變的情況下，對(duì)所建立的方法進(jìn)行溫度穩(wěn)定性驗(yàn)證， 提高多重PCR方法的實(shí)際應(yīng)用性。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物，其特征在于針對(duì)阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌均選擇四種特 異性基因：

阪崎腸桿菌的gyrB基因、grxB基因、ITS基因和CgcA基因；

大腸桿菌的uidA基因、dnaE基因、rfbE基因和phoA基因；

沙門氏菌的mgtC基因、orgC基因、invA基因和FLIC基因；

針對(duì)上述基因設(shè)計(jì)了四套引物，序列為：

第一套特異性引物：

阪崎腸桿菌gyrB基因的上下游引物：