[發明專利]檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物及其魯棒性檢測方法

有效

• 申請號: 202110765594.5
• 申請日: 2021-07-07
• 公開（公告）號: CN113355440B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 劉芝榮;張英華;王玉堂;徐欣;楊思佳
• 申請（專利權）人: 黑龍江省綠色食品科學研究院
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 邱岳

1.檢測巴氏奶致病菌的多重PCR引物，其特征在于針對阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌均選擇四種特異性基因：

阪崎腸桿菌的gyrB基因、grxB基因、ITS基因和CgcA基因；

大腸桿菌的uidA基因、dnaE基因、rfbE基因和phoA基因；

沙門氏菌的mgtC基因、orgC基因、invA基因和FLIC基因；

針對上述基因設計了四套引物，序列為：

第一套特異性引物：

阪崎腸桿菌gyrB基因的上下游引物：

F：CAGGACCACTTCCATTACG

R：CTCGTTCATCTGCTGCTC

大腸桿菌uidA基因的上下游引物：

F：GAACTGAACTGGCAGACTATCC

R：CGTGGTGTAGAGCATTACGC

沙門氏菌的mgtC基因的上下游引物：

F：TCTGGTATTGGCTTTCTGG

R：CGAACCTAACCCTTGTAAACAG

第二套特異性引物：

阪崎腸桿菌grxB基因的上下游引物：

F：TAAACAGTGGTGCGAGTCG

R：TTGACAATCGTGAGCGAG

大腸桿菌dnaE基因的上下游引物：

F：GTCGGGGCAGATTTTAAC

R：TGCGTCAAAGTCGCTGCTG

沙門氏菌的orgC基因的上下游引物：

F：GGTGTGGTTTCGTTGAGTG

R：AAGCGTTTCAGAAGAGGCT

第三套特異性引物：

阪崎腸桿菌ITS基因的上下游引物：

F：GTTGAAGAGGTTTAACTACG

R：GAAGAAGTCTTCGTGCTGCG

大腸桿菌rfbE基因的上下游引物：

F：GTTTATGTTCGGTGGTTGG

R：GACCTCGGGATTGAATACTG

沙門氏菌的invA基因的上下游引物：

F：CTTGATTGAAGCCGATGC

R：AACGATAAACTGGACCACG

第四套特異性引物：

阪崎腸桿菌CgcA基因的上下游引物：

F：CTGGCTTATGGCTATCTTCC

R：GTGATGTCATTGAGGCGTAG

大腸桿菌phoA基因的上下游引物：

F：CGGGCAATACACTCACTATG

R：CTCACCAACTGATAACCACG

沙門氏菌的FLIC基因的上下游引物：

F：TGGATACGCTGAATGTGC

R：TACCACCAAGACCAGTAGCC。

2.利用權利要求1所述引物的巴氏奶中三種致病菌的魯棒性檢測方法，其特征在于包括以下步驟：

（1）阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌DNA模板的制備：分別提取巴氏奶中阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的DNA，作為多重PCR反應待測模板；

（2）建立四套多重PCR反應體系和反應程序：

第一套多重PCR反應體系和反應程序如下：DNA模板各1 μL，Mix 12.5 μL，三種致病菌引物初始濃度為10 μM，添加量分別為0.25 μL、0.25 μL、0.25 μL，ddH₂O 8 μL；95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，58-59.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min進行40個循環，最后72 ℃再延伸7 min；

第二套多重PCR反應體系和反應程序如下：DNA模板各1 μL，Mix 12.5 μL，三種致病菌引物初始濃度為10 μM，添加量分別為0.25 μL、0.25 μL、0.25 μL，ddH₂O 8 μL，95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，57.5-59 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min進行40個循環，最后72 ℃再延伸7 min；

第三套多重PCR反應體系和反應程序如下：DNA模板各1 μL，Mix 12.5 μL，三種致病菌引物初始濃度為10 μM，添加量分別為0.25 μL、0.25 μL、0.25 μL，ddH₂O 8 μL，95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，57-58.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min進行40個循環，最后72 ℃再延伸7 min；

第四套多重PCR反應體系和反應程序如下：DNA模板各1 μL，Mix 12.5 μL，三種致病菌引物初始濃度為10 μM，添加量分別為0.25 μL、0.25 μL、0.25 μL，ddH₂O 8 μL，95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，58-59.5 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min進行40個循環，最后72 ℃再延伸7 min；

（3）PCR產物鑒定：利用所述引物和步驟（2）的反應體系與反應程序對巴氏奶樣品進行檢測，PCR產物經2 %的瓊脂糖凝膠電泳分析測定；

（4）結果觀察：

第一套多重PCR反應中，觀察429 bp、129 bp、339 bp處是否有相應的目的條帶，其 分別對應為阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌；

第二套多重PCR反應中，觀察288 bp、441 bp、144 bp處是否有相應的目的條帶，其 分別對應為阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌；

第三套多重PCR反應中，觀察257 bp、425 bp、118 bp處是否有相應的目的條帶，其 分別對應為阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌；

第四套多重PCR反應中，觀察281 bp、471 bp、129 bp處是否有相應的目的條帶，其 分別對應為阪崎腸桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌。