[發明專利]一種降低畢赤酵母表達外源蛋白氧化修飾的方法

在審

• 申請號: 202110764779.4
• 申請日: 2021-07-07
• 公開（公告）號: CN115595348A
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發明（設計）人: 丁滿生;范敏;趙江彪;胡亮;郝龍;代虎;沈紅
• 申請（專利權）人: 江蘇泰康生物醫藥有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N1/38;C12N1/16;C12R1/84
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為解決畢赤酵母重組發酵生產外源蛋白翻譯后過度修飾的技術問題，本公開提供一種降低畢赤酵母表達外源蛋白氧化修飾的方法，其特征在于以甲醇作為誘導劑和碳源的誘導表達階段，混合補加山梨醇將甲醇代謝中的甲醛異化途徑轉移至TCA途徑；其中，甲醇誘導階段的菌體濃度OD600為225?275，以0.6?1.2mL/h/L初始發酵體積的速率流加山梨醇。通過混補山梨醇甲醇減少了外源蛋白MW05的異常修飾，特別是氧化修飾。

技術領域

本發明屬于生物技術和發酵工程領域，具體涉及一種降低畢赤酵母表達外源蛋白氧化修飾的方法，特別是涉及利用山梨醇/甲醇混合流加技術和低溫甲醇誘導技術降低畢赤酵母表達外源蛋白氧化修飾的方法。

背景技術

畢赤酵母(Pichiapastoris)表達系統已經發展成為一個成熟的外源蛋白表達系統，畢赤酵母菌作為一種單細胞真核生物，既具有原核生物結構簡單遺傳背景清楚的特點，又具有真核生物嚴格的基因調控機制和對表達產物的翻譯后修飾的能力，自身不含有內毒素、熱源、病原體，是一種非常安全的表達宿主，已經成為最有效的表達外源蛋白的表達系統之一。據文獻資料統計已有數千種外源蛋白已經實現了在畢赤酵母體系中成功表達，其中有很多已經實現了大規模工業化生產。近些年，畢赤酵母被美國FDA認定為GRAS(Generally recognized as safe)，為其在食品及醫藥上應用鋪平了道路。畢赤酵母表達外源蛋白具有表達量高、穩定性好、培養成本低和產物易分離純化等優點，適于大體積高密度連續發酵，具有強且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)啟動子等優點，可嚴格控制外源基因的表達。

畢赤酵母高密度流加培養生產表達外源蛋白過程一般由前期細胞培養和后期誘導表達兩個階段構成。在獲取了大量、具有蛋白分泌表達功能的細胞以后，誘導階段通過合理的甲醇誘導來提高單位體積培養液中的目標蛋白表達水平(活性、效價等)，這是實現大規模、商業化藥物蛋白生產的另一個最關鍵因素。外源蛋白的高效誘導與大量獲取功能性生物體同等重要、甚至更加重要。畢赤酵母誘導外源蛋白一般在30℃以下進行，這時，甲醇充當了碳源、能源和誘導劑三重角色，因此，誘導階段的代謝過程以及相應的蛋白誘導表達的控制也更為復雜。國內外有關誘導階段重組畢赤酵母發酵控制的研究報道主要集中在甲醇濃度和pH值的最適控制水平、低溫誘導以及非限制性碳源與甲醇共混流加進行誘導等幾個方面。其中，低溫誘導和山梨醇/甲醇共混流加誘導的公認作用就是抑制蛋白酶的分泌、減少目標蛋白的降解、緩解細胞衰亡，對于蛋白質的結構問題關注較少。

畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源表達外源蛋白時，通常認為通過甲醛異化途徑為提供功能性細胞和目標蛋白的合成提供能量，該途徑在為蛋白合成提供能量的同時，中間代謝產物甲醛等脫離過氧化物酶體進入到液胞內，會對細胞產生毒害作用，導致目標蛋白的濃度或活性低、高效表達難以長時間地持續下去；并且畢赤酵母利用甲醇代謝提供能量是一個耗氧量巨大的反應過程，為了取消氧氣的供給降低發酵成本，需要減少甲醇的供給。在該種情況下表達蛋白會出現大量不定向的修飾(以氧化修飾為主)，MW05重組蛋白尤為明顯，其Cys34存在自由巰基。該基團被氧化后會激發體內的清除機制，縮短其半衰期。從甲醇的代謝途徑分析，可能存在的原因是甲醛異化途徑中占用了大量的GSH從而影響體內氧化還原水平。

發明內容

為解決畢赤酵母重組發酵生產外源蛋白翻譯后過度修飾的技術問題，本公開提供一種降低畢赤酵母表達外源蛋白氧化修飾的方法，其特征在于以甲醇作為誘導劑和碳源的誘導表達階段，混合補加山梨醇將甲醇代謝中的甲醛異化途徑轉移至TCA途徑；其中，甲醇誘導階段的菌體濃度OD600為225-275，以0.6-1.2mL/h/L初始發酵體積的速率流加山梨醇。通過混補山梨醇甲醇減少了外源蛋白MW05的異常修飾，特別是氧化修飾。

具體而言：

一方面，本發明提供一種降低畢赤酵母表達外源蛋白氧化修飾的方法，其特征在于以甲醇作為誘導劑和碳源的誘導表達階段，混合補加山梨醇將畢赤酵母甲醇代謝中的甲醛異化途徑轉移至TCA途徑；