[發(fā)明專利]一種降低畢赤酵母表達(dá)外源蛋白氧化修飾的方法

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• 申請日: 2021-07-07
• 公開（公告）號: CN115595348A
• 公開（公告）日: 2023-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 丁滿生;范敏;趙江彪;胡亮;郝龍;代虎;沈紅
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇泰康生物醫(yī)藥有限公司
• 主分類號: C12P21/00
• 分類號: C12P21/00;C12N1/38;C12N1/16;C12R1/84
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為解決畢赤酵母重組發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白翻譯后過度修飾的技術(shù)問題，本公開提供一種降低畢赤酵母表達(dá)外源蛋白氧化修飾的方法，其特征在于以甲醇作為誘導(dǎo)劑和碳源的誘導(dǎo)表達(dá)階段，混合補(bǔ)加山梨醇將甲醇代謝中的甲醛異化途徑轉(zhuǎn)移至TCA途徑；其中，甲醇誘導(dǎo)階段的菌體濃度OD600為225?275，以0.6?1.2mL/h/L初始發(fā)酵體積的速率流加山梨醇。通過混補(bǔ)山梨醇甲醇減少了外源蛋白MW05的異常修飾，特別是氧化修飾。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體涉及一種降低畢赤酵母表達(dá)外源蛋白氧化修飾的方法，特別是涉及利用山梨醇/甲醇混合流加技術(shù)和低溫甲醇誘導(dǎo)技術(shù)降低畢赤酵母表達(dá)外源蛋白氧化修飾的方法。

背景技術(shù)

畢赤酵母(Pichiapastoris)表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)展成為一個成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，畢赤酵母菌作為一種單細(xì)胞真核生物，既具有原核生物結(jié)構(gòu)簡單遺傳背景清楚的特點，又具有真核生物嚴(yán)格的基因調(diào)控機(jī)制和對表達(dá)產(chǎn)物的翻譯后修飾的能力，自身不含有內(nèi)毒素、熱源、病原體，是一種非常安全的表達(dá)宿主，已經(jīng)成為最有效的表達(dá)外源蛋白的表達(dá)系統(tǒng)之一。據(jù)文獻(xiàn)資料統(tǒng)計已有數(shù)千種外源蛋白已經(jīng)實現(xiàn)了在畢赤酵母體系中成功表達(dá)，其中有很多已經(jīng)實現(xiàn)了大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。近些年，畢赤酵母被美國FDA認(rèn)定為GRAS(Generally recognized as safe)，為其在食品及醫(yī)藥上應(yīng)用鋪平了道路。畢赤酵母表達(dá)外源蛋白具有表達(dá)量高、穩(wěn)定性好、培養(yǎng)成本低和產(chǎn)物易分離純化等優(yōu)點，適于大體積高密度連續(xù)發(fā)酵，具有強(qiáng)且易控的醇氧化酶(Alcohol oxidase，AOX)啟動子等優(yōu)點，可嚴(yán)格控制外源基因的表達(dá)。

畢赤酵母高密度流加培養(yǎng)生產(chǎn)表達(dá)外源蛋白過程一般由前期細(xì)胞培養(yǎng)和后期誘導(dǎo)表達(dá)兩個階段構(gòu)成。在獲取了大量、具有蛋白分泌表達(dá)功能的細(xì)胞以后，誘導(dǎo)階段通過合理的甲醇誘導(dǎo)來提高單位體積培養(yǎng)液中的目標(biāo)蛋白表達(dá)水平(活性、效價等)，這是實現(xiàn)大規(guī)模、商業(yè)化藥物蛋白生產(chǎn)的另一個最關(guān)鍵因素。外源蛋白的高效誘導(dǎo)與大量獲取功能性生物體同等重要、甚至更加重要。畢赤酵母誘導(dǎo)外源蛋白一般在30℃以下進(jìn)行，這時，甲醇充當(dāng)了碳源、能源和誘導(dǎo)劑三重角色，因此，誘導(dǎo)階段的代謝過程以及相應(yīng)的蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的控制也更為復(fù)雜。國內(nèi)外有關(guān)誘導(dǎo)階段重組畢赤酵母發(fā)酵控制的研究報道主要集中在甲醇濃度和pH值的最適控制水平、低溫誘導(dǎo)以及非限制性碳源與甲醇共混流加進(jìn)行誘導(dǎo)等幾個方面。其中，低溫誘導(dǎo)和山梨醇/甲醇共混流加誘導(dǎo)的公認(rèn)作用就是抑制蛋白酶的分泌、減少目標(biāo)蛋白的降解、緩解細(xì)胞衰亡，對于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)問題關(guān)注較少。

畢赤酵母以甲醇作為唯一碳源表達(dá)外源蛋白時，通常認(rèn)為通過甲醛異化途徑為提供功能性細(xì)胞和目標(biāo)蛋白的合成提供能量，該途徑在為蛋白合成提供能量的同時，中間代謝產(chǎn)物甲醛等脫離過氧化物酶體進(jìn)入到液胞內(nèi)，會對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，導(dǎo)致目標(biāo)蛋白的濃度或活性低、高效表達(dá)難以長時間地持續(xù)下去；并且畢赤酵母利用甲醇代謝提供能量是一個耗氧量巨大的反應(yīng)過程，為了取消氧氣的供給降低發(fā)酵成本，需要減少甲醇的供給。在該種情況下表達(dá)蛋白會出現(xiàn)大量不定向的修飾(以氧化修飾為主)，MW05重組蛋白尤為明顯，其Cys34存在自由巰基。該基團(tuán)被氧化后會激發(fā)體內(nèi)的清除機(jī)制，縮短其半衰期。從甲醇的代謝途徑分析，可能存在的原因是甲醛異化途徑中占用了大量的GSH從而影響體內(nèi)氧化還原水平。

發(fā)明內(nèi)容

為解決畢赤酵母重組發(fā)酵生產(chǎn)外源蛋白翻譯后過度修飾的技術(shù)問題，本公開提供一種降低畢赤酵母表達(dá)外源蛋白氧化修飾的方法，其特征在于以甲醇作為誘導(dǎo)劑和碳源的誘導(dǎo)表達(dá)階段，混合補(bǔ)加山梨醇將甲醇代謝中的甲醛異化途徑轉(zhuǎn)移至TCA途徑；其中，甲醇誘導(dǎo)階段的菌體濃度OD600為225-275，以0.6-1.2mL/h/L初始發(fā)酵體積的速率流加山梨醇。通過混補(bǔ)山梨醇甲醇減少了外源蛋白MW05的異常修飾，特別是氧化修飾。

具體而言：

一方面，本發(fā)明提供一種降低畢赤酵母表達(dá)外源蛋白氧化修飾的方法，其特征在于以甲醇作為誘導(dǎo)劑和碳源的誘導(dǎo)表達(dá)階段，混合補(bǔ)加山梨醇將畢赤酵母甲醇代謝中的甲醛異化途徑轉(zhuǎn)移至TCA途徑；