[發明專利]一種用于提取微量新鮮外周血有核細胞蛋白的方法及其專用裝置

在審

• 申請號: 202110764088.4
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113462518A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 應萬濤;楊麗;王明超;翁爽
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院;北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N5/078
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙靜

本發明公開了一種用于臨床微量新鮮外周血制備PBMC蛋白的方法，該方法操作簡單，且在血液起始量低的情況下蛋白回收率能達到后續分析要求。本方法實現了提取20μL～120μL新鮮外周血PBMC蛋白，較大程度上減少了所需臨床新鮮外周血樣本體積和病患負擔。

技術領域

本發明屬于蛋白質組領域，具體涉及一種蛋白質組學微量樣品制備方法，該方法操作簡單快捷，在微量血液樣品中外周血單核細胞蛋白組學制備方面有著優越的性能。

背景技術

新鮮外周血由血清、血細胞和血小板等構成，其中血細胞又分為紅細胞(RBC)和白細胞(WBC)。新鮮外周血單個核細胞(PBMC)是新鮮外周血中具有單個核的細胞，包括淋巴細胞和單核細胞。紅細胞和多核白細胞的比重在1.092左右，單個核細胞的比重為1.075-1.090，血小板為1.030-1.035。因此利用一種介于1.075-1.092之間而近于等滲的溶液作密度梯度離心液，使不同的細胞按相應密度梯度在不同高度分布，紅細胞與白細胞在最底層，密度梯度離心液在第二層，PBMC分布在第三層，血小板與血漿分布最上層。目前還沒有提取微升血液中PBMC的方法。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種蛋白質組學微量血液樣品制備裝置，我們將其命名為PBMC-mCap。該裝置制作方法簡單快速，成本低廉，常規實驗室、臨床醫學檢驗均可完成操作。本裝置可用于微升級血液樣本PBMC的提取，先用該裝置提取PBMC，再提取蛋白并消化成肽段，最后可進行微克蛋白的蛋白質組學研究。該裝置實現了微升級血液PBMC的高效俘獲，減少了對臨床病患新鮮外周血樣本體積的需求。

本發明所提供的蛋白質組學微量血液樣品制備裝置，是以一封閉底部尖頭的200μL的移液槍頭(PBMC-mCap)作為提取PBMC的分離容器，根據血中不同細胞密度不同的特點，先加入密度稍大于PBMC但小于WBC的密度梯度離心液(Lymphoprep^TM淋巴細胞分離液)，離心時實現血液中血細胞的分層，使得PBMC能吸附在PBMC-mCap上，從而滿足微量樣品制備PBMC的需求。

本發明還提供了上述蛋白質組學微量血液樣品制備裝置的制備方法。

本發明所提供的蛋白質組學微量血液樣品制備裝置的制備方法，包括以下步驟：

(a)PBMC-mCap制作：將200μL移液槍頭尖頭底部封閉，以制備細長的分離反應池PBMC-mCap；

(b)清洗PBMC-mCap：待PBMC-mCap封閉冷卻后，使用乙腈清洗PBMC-mCap；

上述方法步驟(a)中，封閉尖頭底部的方法可使用酒精燈外焰迅速封閉移液槍槍頭底部、或者使用其他能封閉移液槍頭底部的方法，如直接生產封閉底部移液槍槍頭和附有移液槍頭蓋等方式。

進一步的，PBMC-mCap離心裝置制作：在1.5mL離心管上加入一個適配器，再將PBMC-mCap作為分離容器置于其適配器上方固定于1.5mL體積EP管中，以便于后續離心步驟。

本發明還提供了一種提取微量血液樣品中外周血單個核細胞(PBMC)的方法。

本發明所提供的提取微量血液樣品PBMC的方法，包括下述步驟：

(1)在PBMC-mCap中加入常溫密度梯度離心液，分別將血液樣品用PBS緩沖液體積比1：1稀釋后小心的平鋪于常溫密度梯度離心液表面；

(2)離心分離PBMC：加入血樣后，用封口膜封閉PBMC-mCap頂部后小心的置于離心機中，離心；

(3)分離PBMC層：先用200μL Pipette Tip移液槍槍頭移除上層血漿與血小板，再換個Pipette Tip移液槍槍頭取PBMC層置于1.5mL離心管中；