[發明專利]一種用于提取微量新鮮外周血有核細胞蛋白的方法及其專用裝置

在審

• 申請號: 202110764088.4
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113462518A
• 公開（公告）日: 2021-10-01
• 發明（設計）人: 應萬濤;楊麗;王明超;翁爽
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍軍事科學院軍事醫學研究院;北京蛋白質組研究中心
• 主分類號: C12M1/00
• 分類號: C12M1/00;C12N5/078
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 趙靜

1.一種蛋白質組學微量血液樣品制備裝置，其特征在于：是以一封閉底部尖頭的200μL的移液槍頭作為提取PBMC的分離容器。

2.權利要求1所述蛋白質組學微量血液樣品制備裝置的制備方法，包括以下步驟：

(a)將200μL移液槍頭尖頭底部封閉，以制備細長的分離反應池PBMC-mCap；

(b)清洗PBMC-mCap：待PBMC-mCap封閉冷卻后，使用乙腈清洗PBMC-mCap，即得所述蛋白質組學微量血液樣品制備裝置。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述步驟(a)中，封閉尖頭底部的方法包括使用酒精燈外焰迅速封閉移液槍槍頭底部、或者使用其他能封閉移液槍頭底部的方法，包括直接生產封閉底部移液槍槍頭和附有移液槍頭蓋的方式。

4.一種提取微量血液樣品中外周血單個核細胞的方法，包括下述步驟：

(1)在權利要求1所述的蛋白質組學微量血液樣品制備裝置中加入常溫密度梯度離心液，分別將血液樣品用PBS緩沖液體積比1：1稀釋后平鋪于所述常溫密度梯度離心液表面；

(2)離心分離PBMC：用封口膜封閉所述蛋白質組學微量血液樣品制備裝置的頂部，并置于離心機中，離心；

(3)分離PBMC層：先用200μL Pipette Tip移液槍槍頭移除上層血漿與血小板，再用新的Pipette Tip移液槍槍頭取PBMC層置于1.5mL離心管中；

(4)裂紅：在含PBMC的離心管中加入1mL紅細胞裂解液，搖晃后，冰上靜置后離心，裂解PBMC中殘留的紅細胞；

(5)清洗PBMC：離心后用移液槍小心移除上清液體，再加入1mL PBS緩沖液離心，最后移除上清；

(6)收集PBMC：在清洗后的PBMC中加入PBS緩沖液，再離心，移除所有上清，收集沉淀，即得。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，所述密度梯度離心液為氯化銨紅細胞裂解液(STEMCELL)；所述血液樣品與所述密度梯度離心液的體積比為1：0.5-2；加入所述血液樣品的體積可在20μL～120μL，加入血液樣品和密度梯度離心液總體積小于300μL；

所述血液樣品為新鮮外周血，優選為取出體內24h的新鮮外周血。

6.根據權利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述步驟(2)中，所述離心的條件為：1180g離心10min。

7.根據權利要求4-6中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟(4)中，所述紅細胞裂解液為氯化銨紅細胞裂解液；

所述步驟(4)中，加入紅細胞裂解液后，不可反復劇烈搖晃PBMC混懸液，輕微搖晃后必須靜置10min；所述離心的條件為：300g離心8min。

8.根據權利要求4-7中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟(5)中，移液槍移除的表面液體根據離心后PBMC分布的高度決定，第一次移除上清液體不小于800μL，第二次移除上清不小于1ml。

9.根據權利要求4-8中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟(5)中，移除所有上清時使用200μL的Pipette Tip移液槍槍頭移除；所述200μL的Pipette Tip移液槍槍頭不可碰到底部PBMC沉淀；所述離心的條件為：300g離心8min。

10.根據權利要求4-9中任一項所述的方法，其特征在于：所述步驟(6)中，所述PBS緩沖液的用量為200μL；所述離心的條件為：1200g離心5min；

所述步驟(1)、(5)、(6)中所述PBS緩沖液的PH為7.3～7.5。