[發明專利]一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110764061.5
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113652384A
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 李偉;肖路遙;賀茹;許丹玲
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/65;C12N15/90;C12R1/225
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 吳爽;徐冬濤

本發明公開了一種副干酪乳桿菌S?NB基因缺失突變株及其構建方法和應用，所述S?NB基因缺失突變株以副干酪乳桿菌S?NB為出發菌株，使所述副干酪乳桿菌S?NB中的cps基因上游片段被敲除質粒攜帶的cps基因上游同源臂基因替換，副干酪乳桿菌S?NB中的cps基因下游基因片段被敲除質粒攜帶的cps基因下游同源臂基因替換；其中，cps基因上游同源臂基因堿基序列如SEQ ID NO:1所示，cps基因下游同源臂基因堿基序列如SEQ ID NO:2所示。與傳統方法相比，本發明中敲除載體構建的成功率達到95％以上，且操作簡單，耗時短，操作周期僅為6?7天；利用本發明構建的敲除載體敲除副干酪乳桿菌S?NB的cps基因，所得cps基因缺失突變株生長不受影響，莢膜層變薄，產生物膜能力下降。

技術領域

本發明涉及一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株及其構建方法和應用，屬于分子生物技術領域。

背景技術

乳酸菌是公認安全的益生菌，在其發酵過程中不僅能賦予食品獨特的質地及風味口感，也具備改善調節機體免疫力、改善人體腸道菌群等益生功能。副干酪乳桿菌作為一種革蘭氏陽性菌，可作為益生菌應用于健康乳制品和保健品的研制。隨著乳酸菌的功能特性和應用研究的深入，利用分子手段和遺傳編輯工具探究乳酸菌的功能性基因，并對其進行改造以觀察乳酸菌功能性的改變已成為近年來的研究熱點。目前應用于乳酸菌基因改造的載體主要以條件型整合載體和帶有反向篩選標記的整合載體為主。在構建基因編輯載體時，研究者通常使用傳統的酶切酶連方法，但對于許多低拷貝質粒而言，酶切后回收效率低，且后續的連接過程耗時長，步驟繁瑣；同時擴增片段存在模板殘留以致在后續篩選階段易出現假陽性，這些都成為乳酸菌基因改造的限制因素。另外，乳酸菌種屬較多，不同種屬間菌株差異性較大，針對不同宿主菌株需采用針對性的外源片段轉化方法。因此，提供一種高效并廣泛適用于副干酪乳桿菌屬的敲除載體構建方法及轉化方法，對于副干酪乳桿菌的遺傳改造具有重要的應用價值。

乳酸菌在宿主腸道中持久發揮益生作用的前提是其必須黏附于宿主腸黏膜上皮細胞表面并能進一步定殖，在腸道中某個部位逐漸形成穩定的菌群。與黏附作用相關的主要是黏附素(磷壁酸、S-層蛋白、脂多糖、肽聚糖、胞外多糖等)的分泌和與黏附素受體結合。位于乳酸菌細胞結構最外層的胞外多糖(exopolysaccharide，EPS)被證明與黏附作用密切相關。EPS通常被分為兩類：分泌到培養基中形成黏液的為黏液多糖(slimeexopolysaccharide，sps)；與細胞壁緊密結合在一起形成一層莢膜，通過簡單離心不能獲得則稱為莢膜多糖(caspular exopolysaccharide，cps)。調控莢膜多糖合成的基因通常位于染色體或質粒上。因此，從分子水平了解副干酪乳桿菌莢膜多糖合成相關基因對其菌株形態、益生功能的影響機制顯得尤為迫切。

發明內容

針對現有技術所存在的不足，本發明的第一個目的在于提供一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株；本發明的第二個目的在于提供一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株的構建方法；該方法可在6-7天內篩選得到目的基因缺失突變株，不含抗生素篩選標記；本發明的第三個目的是提供上述副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株的應用。

本發明解決其技術問題采用的技術方案是：

一種副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)S-NB，保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2021年5月4日，保藏地址：中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：M2021461。