[發明專利]一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 202110764061.5
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113652384A
• 公開（公告）日: 2021-11-16
• 發明（設計）人: 李偉;肖路遙;賀茹;許丹玲
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/65;C12N15/90;C12R1/225
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 吳爽;徐冬濤

1.一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株，其特征在于，以副干酪乳桿菌S-NB為出發菌株，使所述副干酪乳桿菌S-NB中的cps基因上游片段被敲除質粒攜帶的cps基因上游同源臂基因替換，副干酪乳桿菌S-NB中的cps基因下游基因片段被敲除質粒攜帶的cps基因下游同源臂基因替換；其中，cps基因上游同源臂基因堿基序列如SEQ ID NO:1所示，cps基因下游同源臂基因堿基序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根據權利要求1所述的副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株，其特征在于，所述敲除質粒以pNZ5319為骨架。

3.根據權利要求1所述的副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株，其特征在于，所述副干酪乳桿菌S-NB保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏日期：2021年5月4日，保藏地址：中國 武漢 武漢大學，保藏編號為CCTCC NO：M 2021461。

4.一種副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株的構建方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

S1、以pNZ5319質粒為模板，反向PCR擴增出敲除質粒骨架，正向PCR擴增出氯霉素抗性基因；

S2、以副干酪乳桿菌S-NB基因組DNA為模板，分別PCR擴增cps基因上游同源臂基因和cps基因下游同源臂基因；

S3、一步克隆將氯霉素抗性基因、cps基因上游同源臂基因和cps基因下游同源臂基因三片段與敲除質粒骨架進行連接，熱擊轉化大腸桿菌感受態細胞后篩選出敲除質粒；

S4、將步驟S3所得的敲除質粒電轉化至副干酪乳桿菌S-NB感受態細胞中，對轉化后獲得的副干酪乳桿菌S-NB突變株進行雙抗驗證，篩選出雙交換轉化子；

S5、將步驟S4所得的雙交換轉化子制備感受態，電擊轉化pMSPCre質粒，構建副干酪乳桿菌S-NB△cps突變株。

5.根據權利要求4所述的副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株的構建方法，其特征在于，步驟S1中反向PCR擴增出的敲除質粒骨架和正向PCR擴增出的氯霉素抗性基因進行DpnⅠ酶切處理去除模板殘留。

6.根據權利要求4所述的副干酪乳桿菌S-NB基因缺失突變株的構建方法，其特征在于，步驟S4中將敲除質粒電轉化至副干酪乳桿菌S-NB感受態細胞中，電擊轉化參數為：2kV，電擊時間：3mS。

7.權利要求4所述的構建方法構建得到的副干酪乳桿菌S-NB△cps突變株。

8.權利要求6所述的副干酪乳桿菌S-NB△cps突變株在分析莢膜多糖對副干酪乳桿菌益生功能的分子機制中的應用。

9.根據權利要求8所述的應用，所述應用為所述的副干酪乳桿菌S-NB△cps突變株在生物膜的形成方面中的應用。