[發明專利]用于血流感染病原微生物檢測的參考品及其制備方法

有效

• 申請號: 202110763458.2
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113249441B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發明（設計）人: 袁光孝;林東旭;朱方何;任勝強;陳杰
• 申請（專利權）人: 湖南賽哲智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳智趣知識產權代理事務所(普通合伙) 44486
• 代理人: 崔艷崢

本發明公開了一種用于血流感染病原微生物檢測的參考品及其制備方法，包括如下步驟：（1）分別獲得人源細胞和病原微生物的基因組DNA；（2）使用酶切法對人源細胞和病原微生物基因組DNA進行片段化；（3）片段化DNA的回收純化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血漿混合；（6）血流感染檢測參考品的提取與質檢；使用上述制備方法制備得到血流感染病原微生物檢測的參考品。所述參考品來源穩定，接近天然血漿樣本，覆蓋各類病原，定值更準確，可對基于高通量測序的血流感染檢測的檢測結果進行質量評估，可用于不同測序平臺、檢測流程、取樣方式間結果的對比，制定基于高通量測序進行血流感染檢測的技術標準。

技術領域

本發明涉及感染性疾病臨床檢測技術領域，特別涉及一種用于血流感染病原微生物檢測的參考品及其制備方法。

背景技術

血流感染（bloodstream infection，BSI）是指病原微生物進入血流引起的播散感染，是危及人類生命的全身性感染疾病，主要病原微生物包括細菌、真菌及病毒等，可導致菌血癥、敗血癥和膿毒癥，嚴重者可引起休克、播散性血管內凝血（DIC）、多臟器功能衰竭乃至死亡。有統計數據顯示，BSI占社區獲得性（community-acquired，CA）和醫院獲得性（hospital-acquired HA）膿毒癥和膿毒性休克病例的40%，約占ICU獲得性病例的20%。近年來，隨著侵襲性操作的不斷增加及廣譜抗菌藥物、皮質激素等藥物的不合理應用，BSI的發病率及病死率逐年上升，造成了患者住院時間的延長和經濟負擔的增加。因此，血流感染的控制越來越受到人們的關注，而血流感染的檢測也有了更多需求。

無細胞DNA（cell-free DNA，cfDNA），即檢測臨床樣本無菌體液中不含細胞基因組的游離片段化DNA，多數指的是血液分離血漿提取后的游離DNA。當發生血流感染時，病原體在血液中進行繁殖代謝或被白細胞吞噬，其細胞被破壞后會將胞內的DNA釋放到血液中成為血漿游離DNA，因此血漿中會同時存在人源的游離DNA和病原體的游離DNA。從2015年開始，下一代測序（next-generation sequencing，NGS）方法的應用逐漸增多，市面上幾種比較成熟的測序平臺比如華大的BGI/MGI測序平臺，賽默飛的Ion torrent，illumina公司的Miniseq/Nextseq/Hiseq等都可以對cfDNA進行檢測。除了測序平臺的區別，作為應用端開發的檢測流程和方法更是多種多樣，采血管等血液采集裝置種類也數不勝數。如何對不同取樣和檢測流程的cfDNA檢測進行效果對比和質量把控是一個尖銳的問題。雖然市面上有一些cfDNA的參考品，但幾乎都是和血液腫瘤檢測應用方向相關，暫未發現報道過血流感染檢測的參考品。

由于二代測序技術在病原感染的臨床應用近一兩年才開始被臨床認可，目前國外都缺乏統一的血流病原微生物感染參考品做參照以及操作規范標準，無法對不同測序平臺和檢測方法進行評估，因此亟需一種覆蓋各類病原菌、且接近人天然血漿的血流感染病原微生物檢測參考品。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明提出了一種用于血流感染病原微生物檢測的參考品及其制備方法，包括如下步驟：（1）分別獲得人源細胞和病原微生物的基因組DNA；（2）使用酶切法對人源細胞和病原微生物基因組DNA進行片段化；（3）片段化DNA的回收純化；（4）片段化DNA的定值和混合；（5）片段化DNA和血漿混合；（6）血流感染檢測參考品的提取與質檢；使用上述制備方法可制備得到血流感染病原微生物檢測的參考品。

本發明提供一種用于血流感染病原微生物檢測的參考品的制備方法，包括如下步驟：

S1：分別獲得人源細胞和病原微生物的基因組DNA；

S2：使用酶切法對S1得到的人源細胞和病原微生物基因組DNA進行片段化；

S3：片段化DNA的回收純化；

S4：片段化DNA的定值和混合；