[發(fā)明專利]用于血流感染病原微生物檢測的參考品及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110763458.2
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113249441B
• 公開（公告）日: 2021-12-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 袁光孝;林東旭;朱方何;任勝強;陳杰
• 申請（專利權(quán)）人: 湖南賽哲智造科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12Q1/686;C12Q1/6869
• 代理公司: 深圳智趣知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44486
• 代理人: 崔艷崢

1.一種用于血流感染病原微生物檢測的參考品的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1：分別獲得人源細(xì)胞、EB病毒、銅綠假單胞菌、近平滑念珠菌的基因組DNA；使用酶切法分別對人源細(xì)胞、EB病毒、銅綠假單胞菌、近平滑念珠菌的基因組DNA進行片段化；片段化的DNA片段長度在140~175bp之間；

S2：通過生物信息學(xué)手段分別獲得結(jié)核分枝桿菌、解脲支原體、土曲霉的兩段物種特異序列，再通過病原特異引物分別擴增得到所述結(jié)核分枝桿菌、解脲支原體、土曲霉的兩個靶標(biāo)片段，病原特異的引物序列如下表所示：

S3：對S1獲得的片段化DNA和S2獲得的靶標(biāo)片段進行回收純化；

S4：對S1獲得的片段化DNA和S2獲得的靶標(biāo)片段進行定值和混合；

對S1獲得的EB病毒、銅綠假單胞菌、近平滑念珠菌的片段化DNA和S2獲得的結(jié)核分枝桿菌、解脲支原體、土曲霉的靶標(biāo)片段單獨設(shè)計一套探針引物并驗證有效性；進行數(shù)字PCR定值，按照數(shù)字PCR絕對定量結(jié)果進行片段化DNA混合操作，混合后再次進行數(shù)字PCR確認(rèn)混合比例準(zhǔn)確性；

EB病毒、銅綠假單胞菌、近平滑念珠菌定值使用的引物和探針見下表：

結(jié)核分枝桿菌、解脲支原體、土曲霉定值使用的引物和探針見下表：

S5：S1獲得的片段化DNA和S2獲得的靶標(biāo)片段和血漿混合；

將定值好的人源細(xì)胞片段化DNA和S1獲得的EB病毒、銅綠假單胞菌、近平滑念珠菌的片段化DNA和S2獲得的結(jié)核分枝桿菌、解脲支原體、土曲霉的靶標(biāo)片段混合物投入到血漿中，病原靶標(biāo)按等拷貝數(shù)進行充分混合；

S6：血流感染檢測參考品的提取與質(zhì)檢；

提取cfDNA，對提取的cfDNA的片段大小和濃度進行測定并計算cfDNA提取效率，采用數(shù)字PCR對片段化DNA濃度和不同病原微生物間DNA比例關(guān)系進行質(zhì)檢驗證。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S1中所述人源細(xì)胞為Hela細(xì)胞系或炎黃細(xì)胞系。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S1中所述人源細(xì)胞由培養(yǎng)獲得。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S3中采用磁珠進行純化，所述磁珠為1×磁珠。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S4中數(shù)字PCR的操作步驟如下：針對每種病原微生物設(shè)計特異引物和探針，取片段化DNA溶液，使用QX200數(shù)字PCR儀，對片段化DNA溶液進行精確定量，每個做3個重復(fù)，每個重復(fù)做三個復(fù)孔數(shù)字PCR，取平均值，確定病原微生物基因組片段化DNA拷貝數(shù)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S5中混合時間為1h，所述血漿是天然血漿或人工制造的血漿。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述S6中所述提取cfDNA的步驟使用市售的cfDNA提取試劑盒，所述測定并計算cfDNA提取效率使用Qsep100和Qubit4.0。

8.一種用于血流感染病原微生物檢測的參考品，其特征在于，所述參考品通過權(quán)利要求1~7任一項所述的制備方法制備得到。

9.權(quán)利要求8所述的用于血流感染病原微生物檢測的參考品在制備用于以下用途中的產(chǎn)品的應(yīng)用，所述用途選自如下任意一種或多種：

（1）對基于高通量測序的血流感染檢測的檢測結(jié)果進行質(zhì)量評估；

（2）對不同測序平臺、檢測流程、取樣方式間結(jié)果的對比；

（3）制定基于高通量測序進行血流感染檢測的技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)。