[發(fā)明專利]一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速鑒定方法

有效

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• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113637796B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發(fā)明（設計）人: 谷紅倉;于敏;許佩松;王云飛;車仙榮
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州圣庭醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6869;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州華鼎知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

本發(fā)明公開了一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速鑒定方法，分子生物檢測領域，包括如下步驟：步驟一，提取8種皰疹病毒1型單純皰疹病毒、2型單純皰疹病毒、巨細胞病毒、Epstein?Barr病毒、水痘帶狀皰疹病毒、人類皰疹病毒6、人類皰疹病毒7及人類皰疹病毒8的宿主和病毒微生物基因組；步驟二，設計8種皰疹病毒檢測靶標位點的特異性引物，進行第一輪多重PCR擴增；步驟三，使用Index接頭引物對純化產(chǎn)物進行第二輪多重PCR擴增；步驟四，將所有樣本取相同質(zhì)量進行pooling，末端修復加A尾，連接測序接頭即完成文庫構(gòu)建；步驟五，文庫質(zhì)控合格后，進行納米孔測序；本發(fā)明判斷快速準確且高通量，為輔助皰疹的早期發(fā)現(xiàn)提供了技術基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及分子生物學檢測領域，特別是一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速鑒定方法。

背景技術

皰疹病毒屬于皰疹病毒(Herpesviridae)科，是一類有包膜、基因組為雙鏈的DNA病毒。目前發(fā)現(xiàn)的能感染人的皰疹病毒有8種，在臨床上引起了多種嚴重的人類疾病，如發(fā)熱、黃疸、肝脾腫大、腦炎或腦膜炎等。

皰疹病毒感染者因癥狀和體征無特異性，其早期發(fā)現(xiàn)主要依賴于臨床經(jīng)驗判斷。傳統(tǒng)的病毒分離培養(yǎng)、血清學診斷等技術因特異性和靈敏度較低，極易導致誤診和漏診。實時定量PCR由于本身的技術限制或其它多方面因素，會導致大量“假陰性”出現(xiàn)，而且不能滿足大量樣本快速檢測的需求。因此，臨床上急需一種有效利用核酸檢測手段來快速高效高通量且準確的輔助判斷皰疹病毒感染的方法。

納米孔測序是將人工合成的一種多聚合物的膜浸在離子溶液中，多聚合物膜上布滿了經(jīng)改造的穿膜孔的跨膜通道蛋白(納米孔)，也就是Reader蛋白，在膜兩側(cè)施加不同的電壓產(chǎn)生電壓差，DNA鏈在馬達蛋白的牽引下，解螺旋通過納米孔蛋白，不同的堿基會形成特征性離子電流變化信號。該膜具有非常高的電阻。通過納米孔的單分子引起特征性的電流干擾，這被稱為Nanopore信號。

納米孔是對穿過的片段進行測序，而不管DNA片段的長度如何。也不是生成特定長度的序列，這可能是數(shù)百個堿基、或者更多個堿基的序列。Nanopore的長序列簡化了重復區(qū)域的組裝和測序，也提高了物種鑒定和宏基因組實驗的速度。

多重PCR技術可以在一個反應孔中完成多對引物的擴增，即通過一次PCR可完成多個靶標區(qū)域的富集，克服了普通PCR的缺點。但多重PCR技術應用在病毒微生物檢測中容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。

市場需要一種能夠快速準確判斷8種皰疹病毒的方法，輔助皰疹的早期發(fā)現(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速鑒定方法，本發(fā)明判斷快速準確且高通量，為輔助皰疹的早期發(fā)現(xiàn)提供了技術基礎。

為了達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速鑒定方法，包括如下步驟：

步驟一，提取8種皰疹病毒的宿主和病毒微生物基因組；

8種皰疹病毒包括：1型單純皰疹病毒(HSV-1)、2型單純皰疹病毒(HSV-2)、巨細胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、人類皰疹病毒6(HHV-6)、人類皰疹病毒7(HHV-7)及人類皰疹病毒8(HHV-8)；

步驟二，設計8種皰疹病毒檢測靶標位點的特異性引物，在各正向引物的5’端加上接頭序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接頭序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使用含接頭序列的特異性引物的混合物進行第一輪多重PCR擴增，對目的片段進行富集、純化；