[發(fā)明專利]一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202110762867.0
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN113637796B
• 公開（公告）日: 2023-09-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 谷紅倉;于敏;許佩松;王云飛;車仙榮
• 申請（專利權(quán)）人: 杭州圣庭醫(yī)療科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6869;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 杭州華鼎知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 33217
• 代理人: 魏亮

1.一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速檢測引物在制備輔助皰疹早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一，提取8種皰疹病毒的宿主和病毒微生物基因組；

8種皰疹病毒包括：1型單純皰疹病毒(HSV-1)、2型單純皰疹病毒(HSV-2)、巨細胞病毒(CMV)、Epstein-Barr病毒(EBV)、水痘帶狀皰疹病毒(VZV)、人類皰疹病毒6(HHV-6)、人類皰疹病毒7(HHV-7)及人類皰疹病毒8(HHV-8)；

步驟二，設(shè)計8種皰疹病毒檢測靶標(biāo)位點的特異性引物，在各正向引物的5’端加上接頭序列AGGTCTTCACGATACGTCGAG，各反向引物的5’端加上接頭序列GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使用含接頭序列的特異性引物的混合物進行第一輪多重PCR擴增，對目的片段進行富集、純化；

所述8種皰疹病毒檢測靶位點分別為HSV12的gB基因、CMV的IE基因、EBV的EBNA2基因、VZV的DNA?poly基因、HHV-6的UL57基因、HHV-7的UL10基因及HHV-8的ORF26基因；

步驟三，使用Index接頭引物對純化產(chǎn)物進行第二輪多重PCR擴增、純化、定量，在Index各正向引物3’端加上測序接頭AGGTCTTCACGATACGTCGAG，在Index各反向引物3’端加上測序接頭GTCCAATCAGTTGCAGCTTCAG，使每個樣本加上不同Index，完成目標(biāo)片段富集；

步驟四，將帶有不同Index的二輪純化產(chǎn)物質(zhì)控合格后，所有樣本取相同質(zhì)量進行pooling,末端修復(fù)加A尾，連接測序接頭即完成文庫構(gòu)建；

步驟五，文庫質(zhì)控合格后，進行納米孔測序；

步驟二中含接頭序列的特異性引物為：

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速檢測引物在制備輔助皰疹早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，

步驟一中提取8種皰疹病毒的宿主和病毒微生物基因組的具體內(nèi)容包括：

1)將含有微生物的液體加入到離心管中作為樣本；

2)在離心管中加入滅菌后的玻璃珠、蛋白酶K，震蕩研磨；

3)吸取研磨后的液體，加入裂解液，放置；

4)在離心管中加入核酸助沉劑，漩渦混勻；

5)在離心管中加入磁珠，漩渦混勻，放置；

6)將離心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液；

7)將第一洗滌液加入離心管中，靜置，吸出上清液；

8)將第二洗滌液加入離心管中，靜置，完全吸出上清液；

9)向離心管內(nèi)加入洗脫液，漩渦混勻，放置；

10)將離心管置于磁力架上，待磁珠完全聚集后，吸出上清液至另一新的離心管內(nèi)，即得到純化的DNA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速檢測引物在制備輔助皰疹早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述第一輪多重PCR擴增的擴增體系為：

；

擴增程序為：95℃預(yù)變性3分鐘，循環(huán)內(nèi)95℃變性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，20個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后72℃延伸5分鐘；4℃保存。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速檢測引物在制備輔助皰疹早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，

所述第二輪多重PCR擴增的擴增體系為：

；

擴增程序為：補充第二輪多重PCR擴增的程序。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速檢測引物在制備輔助皰疹早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，所述純化采用的方法是磁珠純化。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種基于納米孔測序儀的8種皰疹病毒快速檢測引物在制備輔助皰疹早期發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中的應(yīng)用，其特征在于，

第一輪多重PCR擴增后純化一次，第二輪多重PCR擴增后純化二次。