[發明專利]L-蘇氨酸生產菌株及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202110761641.9
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN115572717A
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 尹春筱;劉慧敏;康培
• 申請（專利權）人: 李巖
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12P13/08;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

本發明提供一種L?蘇氨酸生產菌株及其構建方法與應用。所述生產菌株是利用基因工程手段，在具有蘇氨酸生產能力的細菌基因組中引入突變，使其編碼的CreC蛋白包含R77P突變位點。搖瓶發酵實驗表明，大腸桿菌MHZ?0221?4的L?蘇氨酸產量高于對照菌株MHZ?0215?2，改造后的R77P突變菌株MHZ?0221?4搖瓶平均轉化率20.6％，較出發菌提高4.39個百分點。由搖瓶結果可以得出，改造菌的蘇氨酸生產能力明顯優于出發菌MHZ?0215?2，由此可見，基因creC的R77P點突變可以明顯提高蘇氨酸的生產能力。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說，涉及一種L-蘇氨酸生產菌株及其構建方法與應用。

背景技術

L-蘇氨酸是人和動物生長所必需的8種氨基酸之一，其廣泛應用于飼料、食品添加及藥物輔助材料制備等。目前L-蘇氨酸主要通過微生物發酵生產，多種細菌可用于L-蘇氨酸生產，如大腸桿菌、棒狀桿菌屬、沙雷氏菌屬等的野生型誘導獲得的突變株作為生產菌株。具體實例包括抗氨基酸類似物突變株或甲硫氨酸、賴氨酸、異亮氨酸等多種營養缺陷型(日本專利申請公開號224684/83；韓國專利申請公開號8022/87)。然而，傳統誘變育種由于隨機突變造成菌株生長緩慢及產生較多副產物，不易獲得高產菌株。

隨著全球蘇氨酸需求量的不斷增加，高產蘇氨酸菌株的構建和改造尤為重要。2003年韓國CJ株式會社申請的中國專利CN03811059.8中，利用大腸桿菌，通過缺失蘇氨酸操縱子序列的第-56至-18位的39bp序列，增強蘇氨酸合成關鍵基因thrABC表達，蘇氨酸生產力提高22％。Kwang Ho Lee(Kwang Ho Lee等,Systems metabolic engineering ofEscherichia coli for L-threonine production,Mol Syst Biol.2007；3：149)等利用系統代謝工程策略，通過突變編碼天冬氨酸激酶I和III的基因thrA、lysC解除產物反饋抑制，通過敲除tdh及弱化ilvA來去除副產物甘氨酸、異亮氨酸，通過失活競爭途徑基因metA和lysA為蘇氨酸合成提供了更多前體等，最終獲得的TH28C(pBRThrABCR3)菌株發酵50h可產酸82.4g/L，糖酸轉化率39.3％。2020年梅花集團申請的中國專利ZL201611250306.8中，通過強化pntAB基因和異源引入pyc基因獲得MHZ-0215-2菌株，該菌株蘇氨酸產量為12.4g/L、轉化率約為16.2％且無質粒負擔。其中CreBC雙組分系統是全局感應調節系統，與其他全局調節因子一樣，CreBC影響著細菌生理學的許多不同方面。其中CreC對碳分解代謝和細胞內氧化還原狀態有影響，并且在低氧條件下，還影響大腸桿菌的生長和發酵特性，因此被用于代謝工程生產代謝產物。

發明內容

本發明的目的是提供一種L-蘇氨酸生產菌株及其構建方法與應用。

為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種CreC蛋白突變體，所述突變體包含CreC蛋白第77位氨基酸由R到P的突變。

本發明中，CreC蛋白在NCBI上的參考序列編號為NP_418816.1。

第二方面，本發明提供編碼所述CreC蛋白突變體的核酸分子(包含CGC→CCC突變)。

第三方面，本發明提供含有所述核酸分子的生物材料，所述生物材料包括但不限于重組DNA、表達盒、轉座子、質粒載體、病毒載體或工程菌。

第四方面，本發明提供所述核酸分子或權利要求3所述生物材料的以下任一應用：

(1)用于L-蘇氨酸發酵生產；

(2)用于提高L-蘇氨酸發酵產量；

(3)用于構建產L-蘇氨酸基因工程菌。