[發明專利]L-蘇氨酸生產菌株及其構建方法與應用

在審

• 申請號: 202110761641.9
• 申請日: 2021-07-06
• 公開（公告）號: CN115572717A
• 公開（公告）日: 2023-01-06
• 發明（設計）人: 尹春筱;劉慧敏;康培
• 申請（專利權）人: 李巖
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12P13/08;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 黃爽

1.CreC蛋白突變體，其特征在于，所述突變體包含CreC蛋白第77位氨基酸由R到P的突變；

其中，CreC蛋白在NCBI上的參考序列編號為NP_418816.1。

2.編碼權利要求1所述CreC蛋白突變體的核酸分子。

3.含有權利要求2所述核酸分子的生物材料，所述生物材料為重組DNA、表達盒、轉座子、質粒載體、病毒載體或工程菌。

4.權利要求2所述核酸分子或權利要求3所述生物材料的以下任一應用：

(1)用于L-蘇氨酸發酵生產；

(2)用于提高L-蘇氨酸發酵產量；

(3)用于構建產L-蘇氨酸基因工程菌。

5.L-蘇氨酸生產菌株的構建方法，其特征在于，利用基因工程手段，在具有蘇氨酸生產能力的細菌基因組中引入突變，使其編碼的CreC蛋白包含R77P突變位點；其中，CreC蛋白在NCBI上的參考序列編號為NP_418816.1；

優選地，所述細菌為埃希氏菌屬(Escherichia)菌種。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，其特征在于，所述細菌為大腸桿菌(Escherichia coli)。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，所述大腸桿菌為菌株MHZ-0215-2。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，包括以下步驟：

A、pTargetF-N20(creC R77P)質粒及Donor DNA的構建

A1：以pTargetF質粒為模板，用pTF-sgRNA-F/pTF-sgRNA-R引物對，擴增出帶有N20的pTF線性質粒，使用無縫組裝ClonExpress試劑盒將此線性質粒37℃進行組裝，隨后轉化Trans1-T1感受態細胞，獲得pTargetF-N20(creC R77P)質粒，并進行PCR鑒定及測序驗證；A2：以W3110基因組為模板，用creC-UF/creC-UR引物對，擴增出上游同源臂①；A3：以W3110基因組為模板，用creC-DF/creC-DR引物對擴增出下游同源臂②；A4：以①、②為模板，用creC-UF/creC-DR引物對，擴增出up-creC-down片段，也稱Donor DNA；

B、感受態細胞制備及電轉化

B1：將pCas質粒電轉入MHZ-0215-2感受態細胞中，得到陽性轉化子MHZ-0215-2(pCas)；B2：挑取MHZ-0215-2(pCas)單菌落于5mL含卡那霉素和終濃度為10mM阿拉伯糖的LB試管中，30℃200r/min培養至OD₆₅₀為0.4后制備電轉感受態細胞；B3：將pTargetF-N20(creC R77P)質粒電轉入MHZ-0215-2(pCas)感受態細胞中，涂布于含壯觀霉素和卡那霉素的LB平板上，30℃靜置培養至單菌落可見；

C、重組驗證

C1：使用引物對creC-F/creC-R對上述單菌落進行菌落PCR擴增；C2：將擴增產物送測序，以驗證序列的完整性；

D、構建相關質粒丟失

D1：挑取測序驗證正確的單菌落接種于5mL含卡那霉素及終濃度為0.5mM IPTG的LB試管中，30℃過夜培養后劃線于含卡那霉素的LB平板上；D2：挑取單菌落對點于含卡那霉素、壯觀霉素LB平板和只含卡那霉素的LB平板上，30℃過夜培養，若在含卡那霉素、壯觀霉素的LB平板上不能生長，在卡那霉素的LB平板上生長，表明pTargetF-N20(creC R77P)質粒已丟失；D3：挑取pTargetF-N20(creC R77P)質粒丟失的陽性菌落，接種于無抗LB試管中，42℃培養8h后劃線于LB平板上，37℃過夜培養；D4：挑取單菌落對點于含卡那霉素LB平板和無抗LB平板上，若在含卡那霉素的LB平板上不能生長，在無抗LB平板上生長，表明pCas質粒丟失，得到L-蘇氨酸生產菌株MHZ-0221-4(creC R77P)；

上述方法所使用引物序列如下：

pTF-sgRNA-F：5′-AGTCGCCCGTTTCGCGCCAATATGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA-3′

pTF-sgRNA-R：5′-ATATTGGCGCGAAACGGGCGACTAGTATTATACCTAGGACTGAGCTAGCT-3′

N20-F：5′-TCGCCCGTTTCGCGCCAATATG-3′

creC-UF：5′-AATGAACCCGCGGCGCAGATC-3′

creC-UR：5′-TAATGCCACCGATATTGGCGCGAAACGGGGGATGTTGTAGCTGATTAAACGCCTG-3′

creC-DF：5′-CAGGCGTTTAATCAGCTACAACATCCCCCGTTTCGCGCCAATATCGGTGGCATTA

creC-DR：5′-CAGCGCCTGCGCGAGTTTACG-3′

creC-F：5′-ACCTTACTGCGTCGGGTGAAG-3′

creC-R：5′-AATGCGTAAACATACTGCTC-3′。