[發(fā)明專利]用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法及應(yīng)用方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110758030.9
• 申請(qǐng)日: 2021-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113444264B
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-03-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃寧平;李小佩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 東南大學(xué)
• 主分類號(hào): C08J3/075
• 分類號(hào): C08J3/075;C08J3/24;C08J3/28;C08L89/00;C08L5/08;C12N5/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 成立珍

本發(fā)明公開(kāi)了用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法及應(yīng)用方法，屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，首先合成由Sortase A酶特異性底物短肽接枝的甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸(HAMA)共軛物(HAMA?P)，該底物與一定濃度的Sortase A酶促交聯(lián)，即可獲得可注射的透明質(zhì)酸單網(wǎng)絡(luò)水凝膠。該方法具有原料易得、反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)時(shí)間短、等優(yōu)點(diǎn)。然后制備了酶、光雙交聯(lián)的透明質(zhì)酸?明膠雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠，酶促交聯(lián)的透明質(zhì)酸水凝膠作為第一網(wǎng)絡(luò)快速成膠，紫外光交聯(lián)的甲基丙烯酸化明膠(GelMA)水凝膠作為第二增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)。本發(fā)明所制備的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠為細(xì)胞粘附生長(zhǎng)提供了適宜的支架和三維微環(huán)境，在可注射組織工程、3D打印和細(xì)胞三維培養(yǎng)等方面都有著良好的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)用材料領(lǐng)域，具體涉及用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法及應(yīng)用方法。

背景技術(shù)

水凝膠是被廣泛用于支持組織再生、作為細(xì)胞或藥物的輸送載體，或用于細(xì)胞三維培養(yǎng)應(yīng)用的基質(zhì)材料。透明質(zhì)酸水凝膠(HA)具有生物相容性良好、不易降解、溶脹比高以及結(jié)構(gòu)高度類似于細(xì)胞外基質(zhì)等特點(diǎn)，是很有發(fā)展?jié)摿Φ募?xì)胞三維培養(yǎng)支架材料。

目前，HA水凝膠主要通過(guò)化學(xué)官能團(tuán)修飾，加入交聯(lián)劑交聯(lián)形成具有特定形狀、機(jī)械硬度和生物活性的水凝膠。例如，通過(guò)與硫酸二肼反應(yīng)將-SH共價(jià)交聯(lián)到HA骨架上，并通過(guò)聚乙二醇二丙烯酸酯交聯(lián)，以構(gòu)建生物相容性的HA水凝膠。然而，這些活性試劑很容易發(fā)生副反應(yīng)(與細(xì)胞表面的蛋白質(zhì)反應(yīng)等)，同時(shí)反應(yīng)特異性較差。酶促交聯(lián)反應(yīng)因其溫和的反應(yīng)條件和特異性反應(yīng)引起研究者廣泛的興趣。廣泛存在于細(xì)菌細(xì)胞膜中的半胱氨酸轉(zhuǎn)肽酶A(Sortase A)以其優(yōu)異的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和高度特異性已經(jīng)被應(yīng)用于酶誘導(dǎo)的成鍵反應(yīng)。Sortase A可以催化其中一個(gè)短肽底物中的C端序列LPXTG和另外一個(gè)短肽底物中的N端寡甘氨酸序列(G_n)之間形成新的酰胺鍵。特別地，Sortase A的濃度越高，酶促交聯(lián)反應(yīng)速率越快，因此可作為注射水凝膠的潛在交聯(lián)體系。

值得注意的是，單一的HA水凝膠由于差的細(xì)胞粘附性使得三維培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞形態(tài)始終為球狀，不能促進(jìn)細(xì)胞鋪展。

而GelMA由于與明膠類似的優(yōu)異的細(xì)胞粘附性和細(xì)胞相容性，有利于細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，但是其最大缺點(diǎn)是降解速率較快。因此單網(wǎng)絡(luò)的水凝膠難以同時(shí)兼顧細(xì)胞相容性、機(jī)械強(qiáng)度和長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定培養(yǎng)的要求。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的不足，提供用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法，為細(xì)胞的粘附、鋪展和增殖提供良好的三維仿生環(huán)境，同時(shí)改善了支架材料降解過(guò)快等問(wèn)題；本發(fā)明還提供用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的應(yīng)用方法。

技術(shù)方案：為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：用于細(xì)胞三維培養(yǎng)的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠的制備方法及應(yīng)用方法，雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠由Sortase A酶交聯(lián)的透明質(zhì)酸水凝膠網(wǎng)絡(luò)和光交聯(lián)的明膠水凝膠網(wǎng)絡(luò)兩部分組成，其制備方法包括如下步驟：

(1)Sortase A酶促交聯(lián)底物甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸(HAMA-P)的制備

酶底物短肽P通過(guò)邁克爾加成反應(yīng)，即利用半胱氨酸側(cè)鏈上的-SH官能團(tuán)，直接共軛到甲基丙烯酸化透明質(zhì)酸HAMA的雙鍵上；

(2)HAMA-P/GelMA經(jīng)酶、光雙交聯(lián)制備透明質(zhì)酸-明膠雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠(HAMA-P-GelMA)

將酶促交聯(lián)底物HAMA-P以及水溶性光引發(fā)劑溶于DPBS緩沖液中，得到HAMA-P溶液，然后加入甲基丙烯酸化明膠GelMA溶解完全，混合均勻后加入Sortase A酶溶液并經(jīng)紫外光照射，即得到HAMA-P-GelMA雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠。

進(jìn)一步地，所述的酶底物短肽P為P₁(GGGG)和P₂(LPETG)；酶促交聯(lián)底物HAMA-P的組成為HAMA-P₁和HAMA-P₂。