[發明專利]用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法及應用方法

有效

• 申請號: 202110758030.9
• 申請日: 2021-07-05
• 公開（公告）號: CN113444264B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 黃寧平;李小佩
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C08J3/075
• 分類號: C08J3/075;C08J3/24;C08J3/28;C08L89/00;C08L5/08;C12N5/00
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 成立珍

1.用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）Sortase A酶促交聯底物甲基丙烯酸化透明質酸（HAMA-P）的制備

酶底物短肽P通過邁克爾加成反應，利用半胱氨酸側鏈上的-SH官能團，直接共軛到甲基丙烯酸化透明質酸HAMA的雙鍵上；

（2）HAMA-P/GelMA經酶、光雙交聯制備透明質酸-明膠雙網絡水凝膠（HAMA-P-GelMA）

將酶促交聯底物HAMA-P以及水溶性光引發劑溶于DPBS或TEOA緩沖液中，得到HAMA-P溶液，然后加入甲基丙烯酸化明膠GelMA溶解，混合均勻后加入Sortase A酶溶液并經紫外光照射，即得到HAMA-P-GelMA雙網絡水凝膠。

2.根據權利要求1所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于，所述的酶底物短肽P選自P₁和P₂；對應的，酶促交聯底物HAMA-P的組成為HAMA-P₁和HAMA-P₂。

3.根據權利要求1所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于，所述的HAMA的反應濃度為3~10μM；加入的TEOA緩沖液的濃度為100~500mM，pH為8.0，體積占總體積比的1/3~1；酶底物短肽P與HAMA的摩爾比為1:1~1:2。

4.根據權利要求1所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于，所述的HAMA-P的純化步驟為加入無水乙醇將反應產物析出沉淀、離心，再次溶解于超純水中。

5.根據權利要求2所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于：所述的酶促交聯底物HAMA-P中HAMA-P₁和HAMA-P₂是等質量濃度的，兩者總質量體積濃度為0.25~1%；GelMA的質量體積濃度為5~10%。

6.根據權利要求1所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于：所述的Sortase A酶的交聯濃度為2~100μM。

7.根據權利要求1所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法，其特征在于：所述的水溶性光引發劑為Iragure2959或苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基亞磷酸鋰LAP，對應的紫外光源波長分別為365nm和405nm；使用的質量體積濃度為0.05~1%；紫外光照射時間為10~120s。

8.權利要求1-7中任意一項所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠的制備方法制備得到的用于細胞三維培養的可注射雙網絡水凝膠在體外細胞三維培養中的應用。

9.權利要求8所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠在體外細胞三維培養中的應用的方法，其特征在于，包括如下步驟：

配置含有0.5~1%質量體積濃度的HAMA-P、5~7.5%質量體積濃度的GelMA以及0.25~0.5%質量體積濃度的光引發劑的水凝膠預溶液，完全溶解后除菌；消化培養的貼壁細胞，計數并離心，加入水凝膠預溶液，吹打均勻，使得細胞密度為2000~10000/mL；

加入50~80μM Sortase A酶溶液后快速滴加到PDMS薄膜上，并用玻片覆蓋，紫外光固化，用DPBS淋洗負載細胞的水凝膠若干次，加入DMEM培養液浸沒培養。

10.權利要求9所述的用于細胞三維培養的雙網絡水凝膠在體外細胞三維培養中的應用的方法，其特征在于，所述的除菌是用0.22μm濾膜過濾，所述的紫外光固化時間為10-30s。