[發(fā)明專利]建立實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202110757522.6
• 申請(qǐng)日: 2021-07-05
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN113308522A
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-08-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫成銘;楊新;姜慧慧;彭絨雪;孫茁凱;劉杰;杜江東;孫枝紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 孫成銘;楊新
• 主分類號(hào): C12Q1/6858
• 分類號(hào): C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 溫州青科專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 33390
• 代理人: 錢磊

本發(fā)明公開(kāi)了一種建立實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平的方法，其包括如下步驟：S1.選擇PER2啟動(dòng)子CpG島區(qū)域：1)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到PER2啟動(dòng)子序列；2)通過(guò)CpG島在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)PER2啟動(dòng)子序列所包含的GpG島富集區(qū)并確定目標(biāo)序列；S2.根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)PER2啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和探針；S3.根據(jù)重亞硫酸鹽對(duì)基因序列的轉(zhuǎn)化規(guī)律設(shè)計(jì)目標(biāo)序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相應(yīng)序列，以質(zhì)粒形式保存；S4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化方法的建立及性能確認(rèn)。通過(guò)本發(fā)明可以精確定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平，為研究PER2甲基化提供有效的工具和方法。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及PER2啟動(dòng)子甲基化水平檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種建立實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平的方法。

背景技術(shù)

許多研究證明白血病尤其是髓系白血病患者PER2基因會(huì)發(fā)生高甲基化，PER2甲基化可能是白血病早期診斷、預(yù)后和治療的重要表觀遺傳標(biāo)記。目前有關(guān)PER2啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)多采用的是甲基化特異性MSP法，是一種定性檢測(cè)方法，不易用于動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)和水平的比較。目前尚未有經(jīng)過(guò)嚴(yán)格性能確認(rèn)的PER2基因啟動(dòng)子甲基化定量檢測(cè)的方法，也沒(méi)有可用于定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平的參考物質(zhì)。

H Peng(PMID:31031806)，M Pienkowska(PMID:31409384)等采用亞硫酸鹽焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化。但是該亞硫酸鹽焦磷酸測(cè)序法成本較高。

F Hernandez-Rosas(PMID:30008892)等采用甲基化特異性PCR(MS-PCR)檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化，但該方法只能定性檢測(cè)，無(wú)法做到精確定量，也無(wú)法動(dòng)態(tài)檢測(cè)甲基化水平的變化。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的在于建立一種可靠穩(wěn)定的基于Taqman探針的檢測(cè)PER2基因啟動(dòng)子甲基化水平的實(shí)時(shí)熒光定量MSP方法，即一種建立實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平的方法。

所采用的技術(shù)方案為：

一種建立實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化水平的方法，包括如下步驟：

S1.選擇PER2啟動(dòng)子CpG島區(qū)域：

1)根據(jù)基因數(shù)據(jù)庫(kù)查詢到PER2啟動(dòng)子序列；

2)通過(guò)CpG島在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站預(yù)測(cè)PER2啟動(dòng)子序列所包含的GpG島富集區(qū)并確定目標(biāo)序列；

S2.根據(jù)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)PER2啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物和探針；

S3.根據(jù)重亞硫酸鹽對(duì)基因序列的轉(zhuǎn)化規(guī)律設(shè)計(jì)目標(biāo)序列甲基化和非甲基化序列，并人工合成相應(yīng)序列，以質(zhì)粒形式保存；

S4.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PER2啟動(dòng)子甲基化方法的建立及性能確認(rèn)：篩選合適的引物，并選擇引物探針組合，以相應(yīng)質(zhì)粒為模板，對(duì)檢測(cè)方法的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)，從而確認(rèn)建立的方法的檢測(cè)性能。

進(jìn)一步地，S4中，對(duì)檢測(cè)方法的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)包括對(duì)檢測(cè)方法的靈敏度、特異度、準(zhǔn)確度和擴(kuò)增效率的各性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。

進(jìn)一步地，S4中，對(duì)檢測(cè)方法的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)中，模擬參考物質(zhì)的拷貝濃度計(jì)算方法如下：質(zhì)粒DNA的濃度為20ng/uL。質(zhì)粒濃度換算為拷貝數(shù)計(jì)算公式：拷貝數(shù)(拷貝/μL)＝(質(zhì)粒濃度ng/μL×10-9)×(6.02×1023)/(質(zhì)粒堿基數(shù)×660)，依此公式計(jì)算的到質(zhì)粒拷貝數(shù)為6×109copies/uL；然后將質(zhì)粒MSP-5進(jìn)行連續(xù)10倍倍比稀釋至0.6copies/uL。

進(jìn)一步地，S1中，查詢到PER2啟動(dòng)子序列如SEQ ID NO：1。

進(jìn)一步地，S1中，確定目標(biāo)序列如SEQ ID NO：2。